2) родамин С
3) ФИТЦ
4) метиленовый синий (+)
В окраске по Лёффлеру основным реагентом служит щелочной раствор метиленового синего. Это катионный основной краситель, который связывается с анионными компонентами бактериальной клетки, прежде всего с фосфатными группами нуклеиновых кислот. В результате бактерии окрашиваются в синие тона, хорошо определяются их форма, размеры, характер расположения и некоторые внутриклеточные включения.
Для коринебактерий, особенно при исследовании на Corynebacterium diphtheriae, метод может выявлять метахроматические гранулы Бабеша—Эрнста (волютин): на фоне окрашенного тела клетки они выглядят более интенсивными, иногда сине-фиолетовыми. Дополнительное диагностическое значение имеют полиморфизм, булавовидное утолщение концов и расположение клеток под углом друг к другу или в виде китайских иероглифов . Метахроматические гранулы обусловлены скоплениями полифосфатов, изменяющими оттенок основного красителя.
Окраска по Лёффлеру является ориентировочной и не подтверждает вид бактерии или продукцию дифтерийного токсина самостоятельно. Её ценность состоит в быстрой оценке морфологии возбудителя непосредственно в мазке, тогда как окончательная лабораторная диагностика требует выделения культуры, видовой идентификации и определения токсигенности штамма.
| Метод | Ключевой реагент или принцип | Морфологический результат | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Окраска по Лёффлеру | Щелочной метиленовый синий | Синие клетки; возможны более тёмные метахроматические гранулы | Быстрая оценка формы и расположения коринебактерий в мазке |
| Окраска по Нейссеру | Комбинация метиленового синего, кристаллического фиолетового и контрастного реагента | Гранулы Бабеша—Эрнста окрашиваются интенсивно, тело клетки контрастирует с ними | Более выраженное выявление метахроматических включений |
| Окраска по Альберту | Кристаллический фиолетовый и малахитовый зелёный | Тёмные волютиновые гранулы на зелёном или зеленовато-жёлтом фоне клетки | Дифференциальная оценка коринебактерий по наличию гранул |
| Окраска по Граму | Кристаллический фиолетовый, раствор Люголя, обесцвечивание и контрастный краситель | Коринебактерии обычно грамположительные, но в старых культурах окрашиваются неравномерно | Определение тинкториальной характеристики и общей морфологии |
| Иммунофлуоресценция | Антитела, меченные ФИТЦ | Специфическое свечение антиген-положительных клеток | Более специфичная экспресс-идентификация при наличии валидированных антител |
| Культуральное исследование и тест на токсигенность | Посев на селективные среды, идентификация изолята, реакция Элека или молекулярные методы | Рост колоний и подтверждение видовой принадлежности; оценка продукции токсина | Подтверждение диагноза и эпидемиологически значимой токсигенности |
При подозрении на дифтерию материал из ротоглотки желательно брать до начала антибактериальной терапии. Обнаружение характерных коринебактерий в мазке ускоряет принятие противоэпидемических решений, но не заменяет посев. Наличие гена tox свидетельствует о потенциальной токсигенности, однако продукцию активного токсина целесообразно подтверждать фенотипическим тестом, например реакцией преципитации в агаре по Элеку. мазки и культуры исследуют с соблюдением требований биологической безопасности.