2) инкубация при комнатной температуре
3) введение реакционной смеси морским свинкам
4) учет результата
Первым этапом постановки реакции нейтрализации дифтерийного токсина является смешивание исследуемого токсина со специфическими антитоксическими антителами. Антитела связывают токсин и препятствуют его взаимодействию с рецепторами клеток, проникновению внутрь клетки и реализации ферментативной активности. Дифтерийный токсин относится к АВ-токсинам: его А-субъединица ADP-рибозилирует фактор элонгации EF-2, что блокирует синтез белка и приводит к повреждению клеток; антитоксин предотвращает этот каскад.
После образования комплекса токсин—антитоксин смесь выдерживают в течение установленного времени, чтобы связывание стало максимально полным, а затем вводят восприимчивым животным, обычно морским свинкам. По отсутствию или наличию местных и общих проявлений токсичности, включая отёк, некроз, выраженное ухудшение состояния и гибель, судят о нейтрализации токсина. Поэтому введение смеси животным и последующий учёт результата являются последующими этапами, а не началом реакции.
| Этап или компонент | Содержание | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Специфический антитоксин | Антитела, направленные против антигенных детерминант дифтерийного токсина | Определяет специфичность реакции и связывает токсин до его контакта с клеточными рецепторами |
| Исследуемый токсин | Стандартизованный препарат или материал, содержащий биологически активный токсин | Является объектом нейтрализации; его остаточная активность оценивают по биологическому эффекту |
| Смешивание компонентов | К токсину добавляют определённое количество специфического антитоксина | Формируется иммунный комплекс, от которого зависит последующая потеря токсичности |
| Инкубация | Реакционную смесь выдерживают в заданных условиях и в течение установленного времени | Обеспечивает завершение связывания антител с токсином; преждевременное введение снижает достоверность оценки |
| Введение животным | Подготовленную смесь вводят морским свинкам, чувствительным к действию дифтерийного токсина | Позволяет оценить биологическую активность токсина после контакта с антитоксином |
| Интерпретация результата | Сравнивают состояние животных с контрольными группами, получившими токсин без антитоксина и соответствующие контрольные препараты | Отсутствие токсических проявлений свидетельствует о нейтрализации; развитие типичных реакций указывает на сохранение токсичности |
Реакция является биологическим тестом, поскольку конечный вывод основан не только на факте связывания антител, но и на предотвращении токсического эффекта в организме. Обязательное значение имеют стандартизация доз токсина и антитоксина, одинаковые условия инкубации и наличие контролей. В практической диагностике токсигенность выделенного штамма дополнительно подтверждают иммунологическими или молекулярными методами, выявляющими продукцию либо ген токсина. Наличие гена tox само по себе требует оценки его экспрессии и не заменяет функциональную проверку токсина.