2) размораживают
3) денудируют (+)
4) витрифицируют
Денудация — удаление клеток кумулюса и лучистого венца, окружающих ооцит, с помощью гиалуронидазы и осторожной механической аспирации через пипетку. При классическом оплодотворении in vitro ее обычно выполняют после инкубации ооцита со сперматозоидами, как правило через 16–18 часов. Освобождение ооцита от окружающих клеток позволяет непосредственно оценить наличие двух пронуклеусов и двух полярных телец — морфологических признаков нормального оплодотворения.
Денудация также дает возможность определить степень экструзии первого полярного тельца, выявить отсутствие оплодотворения или патологические варианты — один, три и более пронуклеусов. Декомпактизация относится к другим манипуляциям с клеточными комплексами, а размораживание и витрификация являются криобиологическими процедурами и не используются как способ оценки оплодотворения. При ИКСИ денудация проводится до введения сперматозоида, поскольку необходимо визуализировать зрелый ооцит и наличие первого полярного тельца; при стандартном IVF ее основная цель — последующий контроль оплодотворения.
| Признак или этап | Диагностическое значение |
|---|---|
| Клетки кумулюса и лучистого венца | Могут закрывать оолемму и пронуклеусы, поэтому перед оценкой их удаляют. |
| Денудация | Обеспечивает прямую визуализацию ооцита, полярных телец и пронуклеусов; является правильной манипуляцией для оценки оплодотворения. |
| 2PN + 2PB | Критерий нормально оплодотворенного ооцита: выявляются женский и мужской пронуклеусы и два полярных тельца. |
| Отсутствие пронуклеусов | Может соответствовать неосуществившемуся оплодотворению либо задержке формирования пронуклеусов; результат оценивают с учетом времени наблюдения. |
| 1PN | Атипичный вариант, требующий осторожной интерпретации; возможны асинхронное формирование пронуклеусов или партеногенетическая активация. |
| 3PN и более | Признак патологического оплодотворения, чаще вследствие полиспермии или нарушения выделения второго полярного тельца; такие эмбрионы не используют для переноса. |
| Размораживание и витрификация | Методы криоконсервации и последующего отогрева ооцитов, а не процедуры морфологической оценки факта оплодотворения. |
Оценку проводят в стандартизированное время, поскольку пронуклеусы формируются постепенно и могут быть не видны при слишком раннем осмотре. После денудации дополнительно оценивают зрелость ооцита и состояние цитоплазмы, что важно для интерпретации результата. Обнаружение двух пронуклеусов подтверждает нормальное оплодотворение, но не гарантирует дальнейшее нормальное развитие эмбриона. Соблюдение щадящей техники денудации необходимо для предотвращения повреждения оолеммы и снижения жизнеспособности ооцита.