2) перманганатометрию
3) гравиметрию
4) метод перегонки с водяным паром
Антоцианы — это водорастворимые гликозиды антоцианидинов, относящиеся к флавоноидным соединениям и обусловливающие красную, пурпурную или синюю окраску растительного сырья. Их хромофор поглощает излучение в видимой области спектра, обычно в диапазоне около 510–540 нм; интенсивность поглощения связана с концентрацией вещества согласно закону Бугера—Ламберта—Бера. Поэтому после экстракции антоцианов подходящим растворителем их содержание устанавливают по оптической плотности раствора относительно стандартного образца или калибровочной зависимости.
Для суммарной оценки антоцианов часто применяют дифференциально-спектрофотометрический метод: измеряют поглощение экстракта в буферных растворах с различным значением pH, например около 1,0 и 4,5. При изменении кислотности меняется структура антоциановых форм и их окраска, что позволяет уменьшить влияние других фенольных соединений и выразить результат, например, в эквивалентах цианидин-3-глюкозида. Метод отличается достаточной чувствительностью, быстротой и пригодностью для анализа лекарственного растительного сырья.
Перманганатометрия основана на неспецифическом окислении и не позволяет достоверно выделить вклад антоцианов среди других легкоокисляемых компонентов экстракта. Гравиметрия недостаточно пригодна из-за относительно малых концентраций антоцианов и наличия сопутствующих веществ, а перегонка с водяным паром предназначена преимущественно для выделения летучих компонентов, тогда как антоцианы нелетучи и могут разрушаться при нагревании.
| Подход | Аналитический принцип | Пригодность для антоцианов |
|---|---|---|
| Спектрофотометрия | Измерение поглощения экстракта в видимой области и расчет концентрации по калибровке или стандарту | Основной метод количественной оценки суммы антоцианов |
| Дифференциальная спектрофотометрия по pH | Сравнение оптической плотности при pH около 1,0 и 4,5 с учетом обратимого изменения окраски антоцианов | Повышает селективность и позволяет рассчитывать содержание в эквивалентах цианидин-3-глюкозида |
| Высокоэффективная жидкостная хроматография | Разделение индивидуальных антоцианов с последующим фотометрическим или масс-спектрометрическим детектированием | Предпочтительна для профильного анализа и определения отдельных компонентов, но методически сложнее |
| Перманганатометрия | Титриметрическое окисление восстановителей перманганатом | Неспецифична: одновременно реагируют различные фенольные и иные окисляемые соединения |
| Гравиметрия | Выделение и взвешивание осадка или сухого остатка | Мало пригодна из-за низкого содержания антоцианов и возможного соосаждения балластных веществ |
| Перегонка с водяным паром | Выделение летучих веществ по разнице летучести с водяным паром | Не применяется: антоцианы нелетучи, термолабильны и находятся в растительном сырье преимущественно в клеточном соке |
При подготовке пробы важно защищать экстракт от света, кислорода и чрезмерного нагревания, поскольку эти факторы ускоряют деградацию антоцианов. Кислая среда обычно способствует стабилизации окрашенной флавилиевой формы соединений. Надежность результата оценивают по специфичности, линейности, прецизионности, правильности и стабильности аналитической методики. Для фармакопейной стандартизации дополнительно контролируют подлинность сырья, влажность, содержание примесей и условия хранения.