2) стандартного набора реагентов для мембранного окрашивания
3) реагента для перфорирования мембраны
4) сочетания реагентов для фиксации клетки и перфорирования мембраны (+)
Определение внутриклеточных антигенов методом проточной цитометрии требует предварительной фиксации клеток и последующей пермеабилизации. Фиксация стабилизирует клеточную структуру и закрепляет белки внутри клетки, предотвращая их вымывание и изменение локализации. Перфорирование мембраны с образованием контролируемых пор обеспечивает проникновение флуоресцентно меченых антител в цитоплазму и, при соответствующем протоколе, в ядро.
Стандартное мембранное окрашивание позволяет выявлять только антигены клеточной поверхности, поскольку антитела не проходят через неповреждённую плазматическую мембрану. Полный лизис мембраны разрушает клеточную архитектуру, может приводить к потере растворимых компонентов и снижению достоверности результатов. Поэтому оптимальным является сочетание фиксации и пермеабилизации, причём состав реагентов выбирают с учётом локализации и химических свойств исследуемого антигена.
| Метод обработки | Что выявляется | Основной принцип | Ограничения |
|---|---|---|---|
| Окрашивание интактных клеток | Мембранные антигены | Антитела связываются с эпитопами на наружной поверхности клетки | Внутриклеточные мишени недоступны |
| Фиксация без пермеабилизации | Стабилизированные поверхностные антигены | Сохранение клеточной структуры без формирования доступа внутрь клетки | Недостаточно для цитоплазматических и ядерных белков |
| Фиксация и мягкая пермеабилизация | Цитоплазматические антигены, цитокины | Фиксатор сохраняет белки, а перфорирующий реагент создаёт поры в мембране | Возможна потеря части растворимых белков при чрезмерной обработке |
| Фиксация и пермеабилизация с использованием метанола | Фосфорилированные белки и некоторые внутриклеточные сигнальные молекулы | Органический растворитель одновременно фиксирует и делает мембраны проницаемыми | Может разрушать конформационные эпитопы и некоторые поверхностные антигены |
| Специальная обработка для ядерных антигенов | Транскрипционные факторы, ядерные белки, маркеры пролиферации | Более глубокая пермеабилизация обеспечивает доступ антител к ядру | Требуется валидация клона антитела и режима обработки |
| Полный лизис клеток | Отдельные растворимые компоненты клеточного содержимого | Разрушение клеточной мембраны и клеточной архитектуры | Непригоден для полноценного клеточного фенотипирования методом проточной цитометрии |
Таким образом, ключевым диагностическим принципом является сохранение клетки при одновременном создании доступа антител к внутриклеточной мишени. Выбор фиксатора и пермеабилизирующего реагента должен учитывать, является ли антиген цитоплазматическим, ядерным или фосфорилированным. После такой обработки применяют антитела, валидированные именно для внутриклеточного окрашивания, и соответствующие изотипические или флуоресцентные контроли. Нарушение последовательности фиксация — пермеабилизация — окрашивание может привести к неспецифическому сигналу или ложноотрицательному результату.