2) цитологического исследования
3) секвенирования ДНК
4) метилчувствительной ПЦР (+)
Геномный импринтинг представляет собой эпигенетический механизм, при котором активность аллеля зависит от его родительского происхождения. Основным молекулярным маркером импринтинга служит дифференциальное метилирование CpG-участков в специальных импринтинговых центрах: один родительский аллель метилирован, а другой остаётся неметилированным. Нарушение этого профиля приводит к потере, усилению или патологическому изменению моноаллельной экспрессии генов.
Метилчувствительная ПЦР позволяет различать метилированные и неметилированные последовательности ДНК. Перед амплификацией исследуемую ДНК подвергают бисульфитной конверсии либо обработке метилчувствительными рестриктазами; после этого применяют праймеры или амплификационную схему, специфичную для определённого состояния метилирования. Отсутствие нормального соотношения материнского и отцовского метилированных аллелей указывает на дефект импринтинга, который может быть связан с делецией импринтингового центра, унипарентальной дисомией или эпимутацией.
Обычное секвенирование нуклеотидной последовательности выявляет варианты и небольшие структурные изменения ДНК, но без специальной подготовки образца не определяет метильные метки. Цитологическое исследование предназначено преимущественно для обнаружения крупных хромосомных перестроек, а иммуноферментный анализ оценивает белки, гормоны или антитела и не характеризует эпигенетический статус локуса.
| Метод | Основной диагностический объект | Возможность выявления нарушения импринтинга | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Метилчувствительная ПЦР | Профиль метилирования CpG-участков | Высокая | Выявляет потерю, избыток или аномальное соотношение метилированных аллелей в импринтированном локусе |
| Метилчувствительная мультиплексная лигазная проба, MS-MLPA | Метилирование и число копий ДНК | Высокая | Одновременно обнаруживает нарушения метилирования и делеции либо дупликации исследуемого участка |
| Бисульфитное секвенирование | Метилирование отдельных цитозинов | Высокая | Обеспечивает детальное картирование метилирования, но технически сложнее скрининговой ПЦР |
| Стандартное секвенирование ДНК | Нуклеотидная последовательность | Ограниченная | Обнаруживает патогенные варианты, но обычно не распознаёт метилированный цитозин |
| Цитогенетическое исследование | Число и структура хромосом | Косвенная | Может выявить крупную перестройку, но не определяет эпигенетический профиль импринтингового центра |
| Иммуноферментный анализ | Белки, антитела, гормоны | Отсутствует | Не исследует метилирование ДНК и не устанавливает родительское происхождение аллелей |
Анализ метилирования применяется, в частности, при диагностике синдромов Прадера—Вилли, Ангельмана, Беквита—Видемана и Сильвера—Рассела. Патологический результат подтверждает нарушение импринтинга, однако не всегда сразу определяет его конкретный генетический механизм. Для уточнения причины могут потребоваться исследование числа копий, анализ полиморфных маркеров на унипарентальную дисомию и секвенирование генов или регуляторных областей. Таким образом, метилчувствительная ПЦР является информативным первичным методом оценки эпигенетического состояния импринтированного локуса.