2) флуоресцентной in situ гибридизации с микродиссекционной ДНК-библиотекой из маркерной хромосомы (+)
3) капельной цифровой полимеразной цепной реакцией
4) количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Идентификация маркерной хромосомы наиболее обоснованно выполняется методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с микродиссекционной ДНК-библиотекой, полученной непосредственно из этой маркерной хромосомы. При микродиссекции выделяют материал маркерной хромосомы из метафазной пластинки, амплифицируют его ДНК, метят флуоресцентным красителем и используют полученную библиотеку как зонд для гибридизации с нормальными хромосомами. Совпадение сигнала с определённой хромосомой или её участком устанавливает происхождение маркера; этот вариант метода также называют обратным хромосомным окрашиванием.
Маркерная хромосома представляет собой дополнительную структурно изменённую хромосому, происхождение и содержание которой не удаётся надёжно определить только по стандартному кариотипированию. Субтеломерные FISH-зонды могут выявить утрату или перестройку терминальных участков, но обычно не позволяют установить, из какой хромосомы полностью или преимущественно состоит маркер. Количественная ПЦР и капельная цифровая ПЦР определяют количество заранее выбранных последовательностей и применимы для подтверждения известной CNV или мозаицизма, однако сами по себе не показывают морфологию и хромосомное происхождение неизвестного маркера.
Результат FISH следует интерпретировать с учётом числа исследованных клеток, характера сигнала и возможного мозаицизма. После определения хромосомного происхождения маркера целесообразно уточнить его структуру и размер с помощью хромосомного микроматричного анализа, а при необходимости — таргетного секвенирования или других молекулярно-цитогенетических методов.
| Метод | Принцип | Диагностическая ценность при маркерной хромосоме | Основное ограничение |
|---|---|---|---|
| FISH с микродиссекционной ДНК-библиотекой маркера | Гибридизация меченой ДНК, выделенной из самого маркера, с нормальными метафазными хромосомами | Устанавливает хромосомное происхождение и участки гомологии маркера; позволяет выявлять мозаицизм | Требует качественной микродиссекции и доступных для анализа метафазных клеток |
| FISH с субтеломерными зондами | Проверка терминальных последовательностей всех хромосом или выбранных хромосом | Выявляет терминальные делеции, дупликации и некоторые несбалансированные перестройки | Не всегда определяет состав и происхождение всей маркерной хромосомы |
| Центромерная или локус-специфическая FISH | Гибридизация зонда к центромере или конкретному геномному локусу | Подтверждает наличие определённой центромеры либо участка, если предполагаемое происхождение уже известно | Информативность ограничена выбранными зондами; неизвестный маркер может остаться неидентифицированным |
| Стандартное кариотипирование | Морфологический анализ хромосом в метафазе | Фиксирует наличие дополнительного структурно аномального хромосомного материала и оценивает его количество | Не обеспечивает надёжного определения происхождения небольшого или сложного маркера |
| Хромосомный микроматричный анализ | Геномное выявление прироста и потери копий ДНК | Определяет размер и геномный состав несбалансированного маркера, клинически значимые CNV | Не выявляет сбалансированные перестройки и может не установить структуру маркера или его центромеру |
| Количественная ПЦР в реальном времени | Оценка количества заранее выбранной ДНК по пороговому циклу амплификации | Подтверждает известную делецию или дупликацию в конкретном локусе | Не визуализирует хромосомы и не определяет происхождение неизвестного маркера |
| Капельная цифровая ПЦР | Абсолютное количественное определение мишени в разделённых микрореакциях | Высокочувствительно выявляет низкоуровневый мозаицизм или небольшие изменения числа копий известной последовательности | Также требует заранее выбранной мишени и не заменяет структурную цитогенетическую идентификацию |
Таким образом, ключевым диагностическим признаком правильного подхода является получение зонда из самой маркерной хромосомы и последующее определение его гомологии с нормальными хромосомами. Метод особенно полезен при дополнительных малых маркерах, происхождение которых не устанавливается по форме и размеру. Установленная идентичность маркера позволяет оценить потенциальный геномный дисбаланс, связать находку с клиническим фенотипом и выбрать дальнейшее обследование пациента и членов семьи.