2) CGH
3) mFISH
4) SKY
HR-CGH (high-resolution comparative genomic hybridization, сравнительная геномная гибридизация высокого разрешения) позволяет выявлять несбалансированные хромосомные перестройки — делеции и дупликации — путем сопоставления интенсивности флуоресценции исследуемой и контрольной ДНК, совместно гибридизованных на метафазных или прометафазных хромосомах. Снижение отношения сигналов в определенном участке указывает на утрату генетического материала, а повышение — на увеличение числа копий соответствующего сегмента.
Повышенное разрешение HR-CGH достигается использованием удлиненных прометафазных хромосом, более детального анализа профиля флуоресценции и усовершенствованной цифровой обработки изображения. Метод способен обнаруживать изменения приблизительно от 3–5 млн пар оснований, поэтому подходит для диагностики микроделеций размером не менее 5 Mb. Обычная метафазная CGH характеризуется более низкой разрешающей способностью и надежнее выявляет преимущественно более крупные дисбалансы.
Методы mFISH и SKY основаны на спектральном окрашивании каждой хромосомы в отдельный цвет и особенно полезны для установления происхождения маркерных хромосом и анализа сложных транслокаций. Однако цельнохромосомные окрашивающие зонды не обеспечивают надежного выявления небольших внутрихромосомных потерь, если они существенно не изменяют морфологию хромосомы. Следовательно, среди указанных методов именно HR-CGH наиболее соответствует задаче геномного поиска субмикроскопического количественного дисбаланса.
| Метод | Основной принцип | Тип выявляемых изменений | Ориентировочное разрешение и ограничения |
|---|---|---|---|
| HR-CGH | Сравнение флуоресцентных профилей исследуемой и контрольной ДНК на хромосомах высокого разрешения | Микроделеции и микродупликации | Около 3–5 Mb; не выявляет сбалансированные перестройки |
| Обычная CGH | Конкурентная гибридизация ДНК на метафазных хромосомах | Крупные делеции, дупликации, анеуплоидии | Обычно около 5–10 Mb или ниже в зависимости от качества препарата; чувствительность уступает HR-CGH |
| mFISH | Одновременная гибридизация набора флуоресцентно меченных цельнохромосомных зондов | Сложные транслокации, маркерные хромосомы | Хорошо определяет происхождение хромосомного материала, но малые делеции часто не визуализируются |
| SKY | Спектральное разделение комбинаций флуорохромов для каждой хромосомы | Межхромосомные и сложные перестройки | Ограниченная чувствительность к небольшим внутрихромосомным потерям |
| FISH с локус-специфическим зондом | Гибридизация зонда с заранее выбранным участком генома | Конкретная предполагаемая микроделеция | Высокая локальная чувствительность, но требуется предварительное знание целевого локуса |
| Хромосомный микроматричный анализ | Гибридизация ДНК на матрице геномных зондов | Геномные вариации числа копий | Современное разрешение значительно выше 5 Mb; не выявляет большинство сбалансированных перестроек |
HR-CGH является скрининговым методом, поскольку исследует количественный баланс генетического материала по всему геному без предварительного выбора конкретного локуса. Обнаруженное изменение обычно уточняют локус-специфической FISH, хромосомным микроматричным анализом или молекулярными методами определения границ делеции. В современной клинической генетике для поиска субмикроскопических вариантов числа копий преимущественно применяется хромосомный микроматричный анализ, обладающий существенно более высоким разрешением. Однако в рамках представленного сравнения методов порогу около 5 Mb соответствует именно HR-CGH.