2) флуоресцентной in situ гибридизации с уникальными ДНК-зондами (+)
3) спектрального кариотипирования
4) супрессионной in situ гибридизации
Микроделеционные синдромы обусловлены утратой небольшого участка хромосомы, который может быть невидим при стандартном цитогенетическом исследовании. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с уникальными, или локус-специфическими, ДНК-зондами позволяет адресно исследовать конкретный участок генома, например 22q11.2 при синдроме Ди Джорджи или 7q11.23 при синдроме Вильямса.
При проведении FISH ДНК-зонд, меченный флуорохромом, после денатурации гибридизуется с комплементарной последовательностью на хромосоме. В норме для диплоидной клетки выявляются два сигнала исследуемого локуса; при гетерозиготной микроделеции один из сигналов отсутствует при сохранении сигнала на гомологичной хромосоме. Для контроля обычно используют дополнительный зонд к соседнему или центромерному участку, что позволяет отличить истинную делецию от технической потери сигнала.
Центромеро-специфичные зонды предназначены преимущественно для оценки числа хромосом и выявления анеуплоидий, а не для диагностики утраты субмикроскопического локуса. Спектральное кариотипирование выявляет крупные структурные перестройки и маркерные хромосомы, но имеет ограниченную чувствительность к небольшим делециям. Методы супрессионной гибридизации могут применяться для подавления гибридизации повторяющихся последовательностей, однако сами по себе не являются стандартным адресным тестом для подтверждения конкретного микроделеционного синдрома.
| Подход | Основная мишень | Диагностические возможности | Ограничения |
|---|---|---|---|
| FISH с уникальным локус-специфическим зондом | Неповторяющаяся последовательность в предполагаемом участке делеции | Адресное выявление микроделеции, дупликации или иногда транслокации; оценка мозаицизма | Исследует только участок, для которого выбран зонд; не предназначен для скрининга всего генома |
| Критерий гетерозиготной делеции при FISH | Сигналы на гомологичных хромосомах | Один сигнал вместо двух при сохранном контрольном сигнале и корректной морфологии препаратов | Необходимо учитывать качество гибридизации, неполную пенетрантность мозаицизма и возможные технические артефакты |
| Центромеро-специфический FISH-зонд | Альфа-сателлитная ДНК центромеры | Подсчёт числа соответствующих хромосом, диагностика отдельных анеуплоидий | Не показывает наличие или отсутствие микроделеции в субтеломерном или интерстициальном локусе |
| Спектральное кариотипирование (SKY) | Хромосомы целиком, окрашенные комбинациями флуорохромов | Выявление крупных межхромосомных перестроек, сложных транслокаций и маркерных хромосом | Разрешение ниже, чем требуется для большинства микроделеций |
| Микроматричный анализ хромосом | Копийное число многочисленных участков генома | Геномный поиск делеций и дупликаций, включая большинство микроделеций | Не выявляет сбалансированные перестройки и может не определить низкоуровневый мозаицизм |
| Молекулярно-генетическое секвенирование | Нуклеотидная последовательность генов | Выявление точечных вариантов и небольших инделов; при специальных алгоритмах — некоторых CNV | Не заменяет FISH или микроматричный анализ при подозрении на крупную делецию участка хромосомы |
| Супрессионная гибридизация | Преимущественно повторяющиеся последовательности, блокируемые для повышения специфичности | Вспомогательный принцип подготовки гибридизации и снижения фонового сигнала | Не является самостоятельным стандартным тестом для адресного подтверждения микроделеционного синдрома |
Выбор локус-специфического зонда определяется клиническим подозрением и предполагаемой хромосомной областью. При отсутствии характерного клинического фенотипа или при подозрении на несколько возможных изменений предпочтительнее использовать микроматричный анализ, обеспечивающий геномный поиск вариаций числа копий. Отрицательный результат FISH исключает только делецию, распознаваемую данным зондом, и не исключает другие геномные причины заболевания. Поэтому интерпретацию результата проводят совместно с клиническими данными, родословной и результатами других цитогенетических или молекулярных исследований.