2) диагностика хромосомных инверсий
3) выявление числовых нарушений хромосом в интерфазных ядрах
4) выявление уникальных или низкокопийных последовательностей хромосом (+)
Правильный ответ — выявление уникальных или низкокопийных последовательностей хромосом. При супрессионной in situ гибридизации меченый ДНК-зонд предварительно смешивают с избытком немеченой конкурентной ДНК, обогащённой повторяющимися последовательностями, например Cot-1 DNA. Конкурент связывает входящие в состав зонда повторы Alu, LINE и другие диспергированные элементы, предотвращая их неспецифическую гибридизацию с многочисленными участками генома. В результате отношение специфического сигнала к фону возрастает, а гибридизация преимущественно отражает уникальные и низкокопийные фрагменты зонда.
CISS-метод особенно важен при использовании геномных клонов и сложных библиотек — космидных, BAC- или хромосомоспецифических, — которые наряду с целевыми фрагментами содержат большое количество повторной ДНК. Супрессия повторов позволяет локализовать отдельные участки хромосом, идентифицировать происхождение хромосомного материала и выполнять окрашивание целой хромосомы или её сегмента. Принципиально метод не повышает число копий искомой последовательности, а уменьшает неспецифический фон, делая доступным обнаружение специфического низкокопийного сигнала.
Числовые хромосомные нарушения в интерфазных ядрах обычно выявляют с помощью центромерных или локус-специфических FISH-зондов путём подсчёта сигналов; это применение FISH в целом, а не специфическая область CISS. Для диагностики инверсий необходимы зонды, расположенные по разные стороны точек разрыва, либо ориентационно-специфические варианты FISH. Неоцентромеру подтверждают сочетанием отсутствия обычной альфа-сателлитной ДНК и наличия функциональных белков кинетохора, прежде всего CENP-A или CENP-C, поэтому одна супрессионная гибридизация такой задачи не решает.
| Диагностическая задача | Основной подход | Ожидаемый признак | Роль CISS |
|---|---|---|---|
| Локализация уникальной или низкокопийной последовательности | Геномный клон с конкурентной Cot-1 DNA | Один или несколько дискретных сигналов в соответствующем локусе | Подавляет повторные компоненты зонда и снижает фон |
| Окрашивание целой хромосомы или её сегмента | Хромосомоспецифическая библиотека | Протяжённое равномерное окрашивание целевой хромосомной территории | Обеспечивает специфичность сложной смеси последовательностей |
| Выявление анеуплоидии в интерфазных ядрах | Центромерная или локус-специфическая interphase FISH | Изменение количества сигналов относительно контрольного значения | Не является определяющим принципом исследования |
| Диагностика хромосомной инверсии | Фланкирующие, break-apart- или ориентационно-специфические зонды | Изменение порядка, ориентации или взаимного расположения сигналов | Может применяться при подготовке сложных зондов, но не выявляет инверсию самостоятельно |
| Определение происхождения малой маркерной хромосомы | Центромерная мультицветная FISH, chromosome painting, array-CGH | Установление хромосомы-источника и состава эухроматина | Полезна в составе chromosome painting, но требует дополнительных методов |
| Подтверждение неоцентромеры | Иммунофлуоресценция CENP-A/CENP-C в сочетании с FISH | Функциональные центромерные белки при отсутствии альфа-сателлитного сигнала | Не служит непосредственным тестом функциональной центромеры |
| Исследование высокоповторной гетерохроматиновой последовательности | Прямой сателлитный FISH-зонд | Интенсивный сигнал в центромерном или перицентромерном участке | Супрессия может ослабить сигнал, поскольку повтор является самой мишенью |
Эффективность CISS зависит от соотношения меченого зонда и конкурентной ДНК, сложности зонда, размера его фрагментов и строгости условий гибридизации. Недостаточная супрессия приводит к диффузному окрашиванию и ложному фону, а избыток конкурента может уменьшить интенсивность полезного сигнала. Поэтому CISS следует рассматривать как этап селективного блокирования повторов, а не как самостоятельный способ определения конкретного типа хромосомной аномалии. Этот принцип сохраняет значение в современных протоколах молекулярно-цитогенетического картирования и chromosome painting.