2) исправления мутантных генов
3) нокаута гена (+)
4) увеличения экспрессии определенного белка
Репарация двунитевого разрыва ДНК по типу соединения негомологичных концов (NHEJ, non-homologous end joining) происходит без использования матрицы с гомологичной последовательностью. После внесения разрыва, например нуклеазой Cas9, концы ДНК быстро соединяются, однако в месте восстановления часто возникают небольшие вставки или делеции — инделы. Эти изменения могут нарушить рамку считывания, сформировать преждевременный стоп-кодон и привести к деградации дефектной мРНК или образованию нефункционального белка.
Поэтому NHEJ является основным механизмом получения нокаута гена — стойкой утраты его функционального продукта. Для полного нокаута в диплоидных клетках обычно необходимо повреждение обеих аллелей; при изменении только одной аллели формируется гетерозиготное состояние, а при неодновременном редактировании клеток возможен мозаицизм. В отличие от этого, точное исправление патогенного варианта обычно требует репарации, направляемой гомологией (HDR), с использованием донорной матрицы.
| Подход | Наличие донорской матрицы | Тип генетического изменения | Основное применение |
|---|---|---|---|
| NHEJ | Не требуется | Случайные небольшие делеции или вставки | Нокаут гена за счёт сдвига рамки считывания или появления стоп-кодона |
| Соединение концов, опосредованное микрогомологией (MMEJ) | Не требуется; используются короткие гомологичные участки | Чаще делеции предсказуемого размера, возможны хромосомные перестройки | Получение направленных делеций и альтернативный путь инактивации гена |
| Гомологично направленная репарация (HDR) | Требуется донорская ДНК | Точная замена, вставка или исправление последовательности | Коррекция патогенного варианта или введение заданной генетической конструкции |
| Редактирование оснований | Не требуется двунитевой разрыв | Точечная замена отдельных оснований | Исправление некоторых однонуклеотидных вариантов без формирования инделов |
| Прайм-редактирование | Используется направляющая РНК с матрицей редактирования | Точечные замены и небольшие вставки или делеции | Более широкий спектр точных изменений при снижении риска случайных инделов |
| CRISPR-интерференция (CRISPRi) | Не требуется | Последовательность ДНК обычно не изменяется | Обратимое подавление транскрипции, а не истинный нокаут гена |
Таким образом, характерный результат NHEJ — нарушение структуры кодирующей последовательности и функциональная инактивация гена. Уменьшение экспрессии может быть промежуточным эффектом неполного редактирования или результатом CRISPRi, но не является основным определяющим назначением NHEJ. Для исправления мутантного гена предпочтительны HDR, редактирование оснований или прайм-редактирование в зависимости от типа варианта.