2) многоцветного окрашивания хромосом (mFISH)
3) спектрального кариотипирования хромосом (+)
4) многоцветного сегментирования хромосом (mBAND)
Интерферометр в молекулярно-цитогенетическом исследовании применяется для спектрального кариотипирования хромосом (SKY, spectral karyotyping). Метод основан на регистрации спектрального состава флуоресцентного излучения от каждого участка метафазной хромосомы. Интерферометрическая оптическая система разделяет и анализирует световые сигналы различных длин волн, после чего компьютер присваивает каждой хромосоме индивидуальный псевдоцвет.
При спектральном кариотипировании используют набор ДНК-зондов, меченных комбинациями флуорохромов. Даже при перекрывающихся сигналах их спектральные характеристики распознаются программно, что позволяет одновременно идентифицировать все 24 типа хромосом — 22 аутосомы и половые хромосомы. Это особенно важно для выявления сложных и криптических перестроек, включая транслокации с участием нескольких хромосом, которые могут быть недостаточно заметны при стандартном кариотипировании.
Другие перечисленные методы используют иные технические принципы. Многоцветная FISH применяет набор фильтров для разделения ограниченного числа флуоресцентных меток, mBAND формирует последовательность цветных полос вдоль одной хромосомы, а микродиссекция предусматривает физическое выделение хромосомного материала. Поэтому наличие интерферометрической спектральной регистрации является отличительным признаком именно SKY.
| Метод | Основной принцип | Роль интерферометра | Основной диагностический результат |
|---|---|---|---|
| Спектральное кариотипирование (SKY) | Комбинаторная флуоресцентная маркировка хромосом с анализом полного спектра излучения | Разделение и регистрация спектральных характеристик сигнала в каждой точке изображения | Идентификация всех хромосом и выявление сложных межхромосомных перестроек |
| Многоцветная FISH (mFISH) | Использование нескольких флуорохромов и набора оптических фильтров | Обычно не требуется; сигналы регистрируются в отдельных спектральных каналах | Определение происхождения хромосомных фрагментов и транслокаций |
| Многоцветное сегментирование (mBAND) | Нанесение перекрывающихся зондов, создающих последовательность цветных сегментов вдоль одной хромосомы | Не является обязательным компонентом метода | Локализация внутригромосомных перестроек, инверсий и точек разрыва |
| Микродиссекция хромосом | Микрохирургическое или лазерное выделение отдельной хромосомы либо её участка | Не используется для спектральной идентификации | Получение материала для амплификации, клонирования или молекулярного анализа |
| Стандартное кариотипирование | Анализ числа, размера и полосатости хромосом после дифференциального окрашивания | Не используется | Выявление крупных числовых и структурных аномалий с разрешением, ограниченным длиной полосы |
| Обычная FISH | Гибридизация одного или нескольких локус-специфичных флуоресцентных зондов | Не требуется | Подтверждение конкретной микроделеции, амплификации или транслокации |
Спектральное кариотипирование особенно полезно при опухолевых и врождённых хромосомных перестройках со сложным кариотипом. Метод не заменяет микроматричный анализ или секвенирование, поскольку его разрешение ограничено размером цитогенетически видимых участков. Интерферометр обеспечивает не увеличение разрешения ДНК-анализа, а точное спектральное различение одновременно регистрируемых флуоресцентных сигналов. Именно этот оптический принцип определяет правильность выбора варианта, связанного со спектральным кариотипированием.