2) биобанкирования
3) секвенирования
4) цитогенетического исследования (+)
Костный мозг или периферическую кровь для цитогенетического исследования обычно набирают в стерильную пробирку с гепарином, чаще с натриевым гепарином. Такой антикоагулянт активирует антитромбин III и подавляет тромбин, предотвращая образование сгустка, при этом сохраняет жизнеспособность клеток и их способность к делению. Это принципиально важно для культивирования клеток, остановки деления на стадии метафазы и последующего анализа кариотипа с выявлением числовых и структурных аномалий хромосом.
В костном мозге многие клетки пролиферируют спонтанно, а лимфоциты периферической крови при необходимости стимулируют митогенами. После кратковременного культивирования клетки фиксируют и исследуют с помощью GTG-методики, FISH или других цитогенетических методов. При гемобластозах такой материал позволяет обнаружить клональные изменения: транслокации, делеции, дупликации, инверсии, анеуплоидию и маркерные хромосомы, имеющие диагностическое и прогностическое значение.
Для молекулярно-генетических исследований чаще используют кровь с ЭДТА или специально стабилизирующие пробирки. ЭДТА удобна для выделения ДНК, однако хелатирование ионов кальция и воздействие на клетки могут снижать пригодность образца для клеточного культивирования. Гепарин, напротив, способен ингибировать ДНК-полимеразы, поэтому его наличие нежелательно для ПЦР и ряда вариантов секвенирования, если методика лаборатории специально не валидирована для такого материала.
| Вид исследования | Предпочтительный материал и антикоагулянт | Основной диагностический результат | Преаналитическое обоснование |
|---|---|---|---|
| Классическое кариотипирование | Костный мозг или периферическая кровь с гепарином | Число хромосом, крупные структурные перестройки, клональные аномалии | Необходимы живые клетки, способные к делению и формированию метафазных пластинок |
| FISH-исследование | Свежий гепаринизированный материал либо фиксированные клетки | Целевые транслокации, делеции, амплификации и анеуплоидия | Флуоресцентные ДНК-зонды гибридизуются с сохранёнными хромосомными или интерфазными ядрами |
| ПЦР | Кровь с ЭДТА или выделенная ДНК | Точечные варианты, небольшие инсерции/делеции, специфические транскрипты | Гепарин может ингибировать ДНК-полимеразу и приводить к ложноотрицательному результату |
| Секвенирование нового поколения | Кровь с ЭДТА, костный мозг или выделенная ДНК/РНК в соответствии с протоколом | Широкий спектр нуклеотидных вариантов и небольших перестроек | Требуются достаточное количество и качество нуклеиновых кислот, отсутствие ингибиторов |
| Биобанкирование | Материал в валидированной системе криоконсервации или в пробирках для стабилизации ДНК/РНК | Длительное сохранение клеток или нуклеиновых кислот для последующих исследований | Ключевыми являются стандартизованные условия замораживания, температура и контроль качества, а не сам факт наличия гепарина |
| Общеклиническое исследование крови | Кровь с ЭДТА | Клеточный состав, показатели гемограммы и морфология форменных элементов | ЭДТА эффективно предотвращает агрегацию клеток и сохраняет их морфологию, но не предназначена для культивирования метафаз |
Для цитогенетики образец должен быть доставлен в лабораторию как можно быстрее, поскольку жизнеспособность клеток и митотическая активность постепенно снижаются. Важно использовать именно стерильный гепарин без дополнительных консервантов и соблюдать требования лаборатории к объёму и срокам транспортировки. Выбор пробирки определяется не только типом биоматериала, но и необходимостью сохранить либо живые клетки, либо очищенные нуклеиновые кислоты. Поэтому гепаринизированная кровь или костный мозг являются стандартным преаналитическим материалом прежде всего для цитогенетического исследования.