2) и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или интерфазных ядрах in situ (+)
3) групп-специфических аллельных вариантов генов
4) и определения положения специфической последовательности РНК в ходе амплификации исследуемой последовательности после их гибридизации
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) предназначена для выявления определённых последовательностей нуклеиновых кислот непосредственно в клетках или тканевых срезах с сохранением их пространственного расположения. Для этого используют флуоресцентно меченый олигонуклеотидный или ДНК-зонд, комплементарный исследуемому участку генома. После денатурации ДНК зонд гибридизуется с соответствующей последовательностью, а образовавшийся сигнал визуализируют методом флуоресцентной микроскопии.
На метафазных хромосомах FISH позволяет локализовать ген или участок ДНК, а также выявлять делеции, дупликации, амплификации и хромосомные транслокации. В интерфазных ядрах метод применяют для быстрой оценки числа копий определённой последовательности и обнаружения анеуплоидий без предварительного культивирования клеток. Поэтому правильным является вариант, связанный с определением положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах.
| Подход | Исследуемая мишень | Основной принцип | Типичный результат |
|---|---|---|---|
| FISH на метафазных хромосомах | Специфический участок геномной ДНК | Гибридизация флуоресцентного зонда с комплементарной последовательностью | Цитогенетическое картирование локуса, выявление транслокаций и делеций |
| FISH в интерфазных ядрах | ДНК в неделящихся клетках | Подсчёт и оценка расположения флуоресцентных сигналов | Определение числа копий гена или хромосомы, выявление амплификации и анеуплоидии |
| ДНК-зонд | Комплементарная нуклеотидная последовательность | Прямая или непрямая флуоресцентная маркировка | Сигнал в месте расположения искомого генетического участка |
| Иммуногистохимия | Белок или другой антиген | Связывание специфического антитела с антигеном | Окрашивание клеток с определённым белковым маркером; это не FISH |
| ПЦР и секвенирование | Фрагмент ДНК или отдельный нуклеотидный вариант | Амплификация и/или определение нуклеотидной последовательности | Генотипирование, выявление мутаций и аллельных вариантов без пространственной локализации в ядре |
| RNA-FISH | Молекулы РНК внутри клеток | Гибридизация меченого зонда с комплементарной РНК | Локализация транскриптов и оценка их клеточной экспрессии; амплификация для метода не обязательна |
| Интерпретация FISH-сигнала | Число и расположение флуоресцентных точек | Сопоставление сигнала с контрольным зондом и морфологией клетки | Подтверждение геномного дисбаланса или структурной перестройки |
Ключевым диагностическим признаком FISH является не только наличие сигнала, но и его число, локализация и взаимное расположение с другими зондами. Метод особенно полезен при исследовании опухолевых клеток, когда требуется быстро подтвердить амплификацию онкогена или специфическую транслокацию. Результаты FISH оценивают с учётом контрольных образцов, порогов позитивности и клинико-морфологических данных. При необходимости их дополняют кариотипированием, ПЦР или секвенированием.