2) с активаторами свертывания без разделительного геля
3) без добавления антикоагулянта
4) с активаторами свертывания и разделительным гелем
Для иммунологического определения субпопуляций лимфоцитов используют цельную венозную кровь с антикоагулянтом ЭДТА, обычно K2ЭДТА или K3ЭДТА. ЭДТА связывает ионы кальция, необходимые для активации факторов коагуляции, поэтому предотвращает образование сгустка и сохраняет клетки в суспензии. Это позволяет провести лизис эритроцитов, окрашивание лейкоцитов моноклональными антителами и последующий анализ методом проточной цитометрии.
При таком исследовании оценивают экспрессию поверхностных CD-маркеров: CD3 характеризует Т-лимфоциты, CD4 и CD8 — основные субпопуляции Т-клеток, CD19 или CD20 — В-лимфоциты, CD16/CD56 — NK-клетки. Важна сохранность клеточной морфологии и антигенного профиля, поскольку изменение экспрессии маркеров или разрушение клеток может привести к недостоверному определению абсолютного и относительного содержания субпопуляций. Сыворотка, полученная после свертывания крови, для этой цели непригодна: форменные элементы удаляются вместе со сгустком или осадком.
Пробирки с разделительным гелем и активаторами свертывания предназначены преимущественно для получения сыворотки и биохимических или серологических исследований. Отсутствие антикоагулянта также приводит к агрегации и фрагментации клеток, а цитратная кровь может давать разбавление образца и изменять расчет клеточных показателей. Поэтому для стандартного иммунofenотипирования лимфоцитов у детей предпочтительна цельная кровь с ЭДТА при соблюдении сроков доставки и условий хранения.
| Тип образца | Основной механизм или особенность | Пригодность для определения субпопуляций лимфоцитов |
|---|---|---|
| Цельная кровь с ЭДТА | Хелатирование Ca2+ и подавление свертывания; клетки сохраняются в суспензии | Стандартный материал для проточной цитометрии и оценки CD-маркеров |
| Цельная кровь с гепарином | Ингибирование тромбина и ряда факторов коагуляции без хелатирования кальция | Может использоваться по локальному протоколу, особенно для функциональных тестов; не является типичным выбором в данном задании |
| Кровь с активатором свертывания без геля | Формирование фибринового сгустка и отделение клеток от сыворотки | Непригодна для стандартного подсчета лимфоцитарных субпопуляций |
| Кровь с активатором свертывания и разделительным гелем | После центрифугирования гель разделяет сыворотку и клеточную массу | Предназначена для сывороточных исследований, а не для клеточного иммунophenотипирования |
| Кровь без добавления антикоагулянта | Спонтанное свертывание, агрегация и возможная потеря клеток в сгустке | Не обеспечивает надежного сохранения клеточного состава |
| Кровь с цитратом натрия | Обратимое связывание кальция и разбавление образца раствором антикоагулянта | Используется главным образом для коагулологических тестов; для подсчета лимфоцитов не является стандартным материалом |
После взятия пробирку с ЭДТА необходимо осторожно перемешать инверсионными движениями, не допуская гемолиза и образования микросгустков. Исследование выполняют в сроки, установленные лабораторным регламентом, поскольку длительное хранение изменяет жизнеспособность клеток и интенсивность экспрессии антигенов. Результат обычно представляют как относительное содержание клеток и их абсолютное число, рассчитанное с учетом общего числа лимфоцитов.