2) инкубация биологической пробы в лизирующем буфере
3) выделение вируса на микроцентрифужных колонках
4) амплификация в реальном времени
Для выявления РНК-содержащих вирусов перед амплификацией необходима реакция обратной транскрипции. На этом этапе фермент обратная транскриптаза синтезирует комплементарную ДНК (кДНК) на матрице вирусной РНК. Полученная кДНК становится доступной для последующей амплификации ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, поскольку стандартная ПЦР непосредственно увеличивает количество ДНК, но не РНК.
Обратная транскрипция может выполняться отдельной реакцией или быть объединена с амплификацией в формате одноэтапной ОТ-ПЦР. Лизис образца и выделение нуклеиновых кислот на колонках применяются при исследовании как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов, а режим реального времени характеризует способ регистрации накопления ампликона и также не является специфичным признаком РНК-вирусов. Поэтому именно синтез кДНК представляет собой дополнительную технологическую стадию.
| Критерий | Выявление ДНК-содержащих вирусов | Выявление РНК-содержащих вирусов | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Исходная матрица | Вирусная ДНК | Вирусная РНК | Определяет необходимость предварительного преобразования матрицы |
| Дополнительный этап | Не требуется | Обратная транскрипция с образованием кДНК | Является отличительным этапом при работе с РНК |
| Ключевой фермент | ДНК-зависимая ДНК-полимераза | Сначала обратная транскриптаза, затем ДНК-полимераза | Ферментативная последовательность обеспечивает получение амплифицируемой ДНК |
| Формат постановки | ПЦР или ПЦР в реальном времени | Одноэтапная или двухэтапная ОТ-ПЦР | ОТ указывает на наличие обратной транскрипции |
| Лизис и выделение нуклеиновой кислоты | Применяются | Применяются | Это общие стадии пробоподготовки, а не специфический признак РНК-вирусов |
| Регистрация результата | Флуоресцентная регистрация ампликона возможна | Флуоресцентная регистрация ампликона возможна после обратной транскрипции | Реальное время отражает метод детекции, а не тип генома вируса |
| Критический фактор качества | Сохранность ДНК и отсутствие ингибиторов | Сохранность РНК, защита от РНКаз и эффективность обратной транскрипции | Нарушение любого этапа может привести к ложноотрицательному результату |
При исследовании РНК-вирусов необходимо использовать внутренний контроль, позволяющий оценить качество выделения, эффективность обратной транскрипции и отсутствие ингибирования амплификации. Положительный контроль подтверждает работоспособность реагентов и оборудования, а отрицательный — отсутствие контаминации. РНК отличается меньшей стабильностью по сравнению с ДНК, поэтому важны соблюдение холодовой цепи, применение РНКаз-свободных материалов и минимизация времени до стабилизации образца.