2) определение последовательности нуклеотидов ДНК (+)
3) исследование взаимодействия ДНК с белками
4) исследование идентификации белков
Секвенирование ДНК — это лабораторное определение точной последовательности нуклеотидов в молекуле или выбранном участке генома. Устанавливается порядок оснований аденина, тимина, гуанина и цитозина, что позволяет выявлять однонуклеотидные варианты, небольшие вставки и делеции, а при использовании соответствующих технологий — структурные перестройки и повторяющиеся последовательности.
Молекулярной основой метода является комплементарное спаривание оснований при синтезе новой цепи ДНК. В классическом методе Сэнгера регистрируется прекращение синтеза после включения дидезоксинуклеотида, а в технологиях нового поколения — сигнал от последовательного присоединения нуклеотидов или изменения электрического тока при прохождении цепи через нанопору. Полученные фрагменты анализируются с помощью программного выравнивания с референсной последовательностью и последующего выявления генетических вариантов.
Секвенирование принципиально отличается от кариотипирования и других методов сортировки или визуализации хромосом, поскольку исследует не число и форму хромосом, а их нуклеотидный состав. Оно также не предназначено непосредственно для изучения взаимодействия ДНК с белками и идентификации белковых молекул; для этих задач применяют, например, иммунопреципитацию хроматина, методы связывания ДНК с белками, масс-спектрометрию или иммунологические исследования.
| Подход | Принцип регистрации сигнала | Основные особенности и применение |
|---|---|---|
| Метод Сэнгера | Терминация синтеза цепи дидезоксинуклеотидами | Высокая точность при анализе отдельных генов или небольших фрагментов; низкая пропускная способность |
| Секвенирование по синтезу коротких прочтений | Регистрация флуоресцентного сигнала при включении комплементарного нуклеотида | Высокая точность и параллельный анализ большого числа фрагментов; ограниченная длина прочтений |
| Полупроводниковое секвенирование | Измерение изменения pH при высвобождении протонов во время синтеза | Быстрый анализ панелей генов; возможны ошибки при определении длины гомополимерных участков |
| Нанопоровое секвенирование | Изменение электрического тока при прохождении ДНК через нанопору | Длинные прочтения и возможность анализа в реальном времени; точность зависит от платформы и алгоритмов коррекции |
| Секвенирование в реальном времени одиночных молекул | Регистрация флуоресцентного сигнала при синтезе одной молекулы ДНК | Длинные прочтения, полезные для структурных вариантов, повторов и определения изоформ транскриптов |
| Таргетное секвенирование | Секвенирование заранее выбранных генов или участков | Высокая глубина покрытия и экономичность при диагностике наследственных и онкологических заболеваний |
В клинической лабораторной диагностике результат секвенирования оценивают с учетом качества образца, глубины покрытия, качества прочтений и подтверждения клинически значимых вариантов. Для интерпретации находок используют референсные геномы, популяционные базы данных и критерии классификации вариантов, например категории патогенный, вероятно патогенный, вариант неопределенного значения, вероятно доброкачественный и доброкачественный. Диагностическое значение имеет не только факт обнаружения варианта, но и его связь с фенотипом, типом наследования и клиническими рекомендациями. sal