2) анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
3) секвенирование по Сэнгеру
4) массовое параллельное секвенирование (+)
Предпочтительным методом является массовое параллельное секвенирование (NGS), прежде всего таргетное секвенирование мультигенной панели. Оно позволяет одновременно исследовать сотни генов и выявлять варианты нуклеотидной последовательности в большом числе экзонов и прилегающих участков. В отличие от последовательного анализа каждого гена, NGS существенно сокращает сроки исследования и расход биологического материала.
Метод основан на параллельном прочтении множества фрагментов ДНК с последующим сопоставлением полученных последовательностей с референсным геномом. При достаточном покрытии мишеней выявляются однонуклеотидные варианты и небольшие инсерции или делеции; некоторые платформы и алгоритмы также позволяют оценивать изменения числа копий. Результат требует контроля качества покрытия, оценки аналитической чувствительности и интерпретации вариантов с учётом клинического фенотипа, популяционных баз данных и критериев ACMG/AMP.
Секвенирование по Сэнгеру рационально при анализе одного гена или подтверждении отдельных вариантов, но малоэффективно для сотен генов. Мультиплексная лигазо-зависимая амплификация преимущественно обнаруживает делеции и дупликации экзонов, а анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов применим только к вариантам, изменяющим сайт рестрикции. Поэтому для первичного поиска генетических причин заболевания в широкой группе генов оптимален NGS, дополненный методами подтверждения или дообследования при необходимости.
| Метод | Основной принцип | Типичные выявляемые изменения | Рациональная область применения |
|---|---|---|---|
| Массовое параллельное секвенирование | Параллельное прочтение большого числа фрагментов ДНК и биоинформатический анализ | Однонуклеотидные варианты, небольшие инсерции и делеции; при соответствующей валидации — CNV | Одновременный поиск вариантов в десятках и сотнях генов, экзомное или панельное исследование |
| Секвенирование по Сэнгеру | Терминация синтеза цепи ДНК мечеными дидезоксинуклеотидами | Варианты в ограниченном числе заранее выбранных участков | Подтверждение находки NGS или исследование небольшого числа экзонов |
| MLPA | Гибридизация зондов и лигирование с последующей количественной амплификацией | Делеции и дупликации отдельных экзонов или генов | Поиск изменений числа копий при подозрении на экзонные CNV |
| Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов | Расщепление ДНК рестриктазой с последующим разделением фрагментов | Только варианты, создающие или устраняющие сайт рестрикции | Исследование известных полиморфизмов в отдельных локусах |
| Таргетная панель генов | Селективное обогащение заданных генов перед NGS | Варианты в генах, включённых в панель, при достаточном покрытии | Заболевания с генетической гетерогенностью и сходным клиническим фенотипом |
| Экзомное или геномное секвенирование | Исследование всех кодирующих областей или практически всей геномной последовательности | Широкий спектр точечных вариантов и малых инделов; возможности зависят от платформы и анализа | Неясный молекулярный диагноз, отсутствие подходящей панели или подозрение на редкий ген |
Перед исследованием формируют перечень генов и оценивают клиническую обоснованность выбранной панели. В отчёте необходимо указывать глубину и равномерность покрытия, долю исследованных мишеней и ограничения метода. Клинически значимые находки при необходимости подтверждают независимым методом, особенно при низкой аллельной доле или пограничном качестве сигнала. Отрицательный результат не исключает варианты в плохо покрытых участках, глубоких интронах, повторяющихся последовательностях и сложных структурных перестройках.