2) 95
3) 72 (+)
4) 55
Полимеризация новых цепей ДНК в стандартной ПЦР происходит при температуре 72 °C, оптимальной для термостабильной ДНК-полимеразы Taq. На этом этапе фермент присоединяет дезоксирибонуклеозидтрифосфаты к 3′-концу праймера и синтезирует комплементарную цепь в направлении 5′→3′. Для реакции необходимы матричная ДНК, праймеры, dNTP, ионы магния и буфер, поддерживающий активность полимеразы.
Температурный режим ПЦР основан на последовательном изменении состояния двуцепочечной ДНК. При денатурации цепи разделяются, при отжиге праймеры комплементарно связываются с матрицей, а при элонгации происходит удлинение праймеров и формирование ампликона. Температура около 55 °C обычно применяется для отжига и зависит от температуры плавления праймеров, тогда как 95 °C используется преимущественно для денатурации.
В каждом цикле синтезируются две новые цепи, поэтому при достаточной эффективности реакции целевой фрагмент амплифицируется экспоненциально. Продолжительность элонгации рассчитывают с учётом длины ампликона и скорости работы полимеразы; для Taq часто ориентируются примерно на 30–60 секунд на 1 кб ДНК. В специализированных протоколах температура может отличаться при использовании высокоточных или быстродействующих полимераз, однако для классической ПЦР базовым значением остаётся 72 °C.
| Этап ПЦР | Типичная температура | Основной молекулярный процесс | Диагностическое или методическое значение |
|---|---|---|---|
| Начальная денатурация | 94–98 °C | Разделение исходной двуцепочечной ДНК | Обеспечивает доступ праймеров к матричным цепям |
| Денатурация в цикле | 94–98 °C | Разрыв водородных связей между цепями ампликона | Подготавливает ДНК к новому циклу копирования |
| Отжиг праймеров | 50–65 °C | Гибридизация праймеров с комплементарными участками матрицы | Определяет специфичность реакции; температура связана с Tm праймеров |
| Элонгация | Около 72 °C | Удлинение праймера термостабильной ДНК-полимеразой в направлении 5′→3′ | Формирование полноразмерной копии целевого фрагмента |
| Конечная элонгация | Около 72 °C | Завершение синтеза неполных цепей | Повышает долю полноразмерных ампликонов перед анализом |
| Охлаждение и хранение | 4–10 °C | Замедление ферментативных и гидролитических процессов | Сохраняет продукт реакции до электрофореза, секвенирования или детекции в реальном времени |
Корректная температура элонгации обеспечивает высокую скорость и воспроизводимость синтеза ампликона. Отклонение от оптимума может снижать выход продукта или увеличивать долю неполных фрагментов. Результат ПЦР оценивают по наличию специфического ампликона, например электрофоретически или по флуоресцентному сигналу в ПЦР в реальном времени. Интерпретация всегда должна учитывать отрицательные и положительные контроли, поскольку они позволяют выявить контаминацию и ингибирование реакции.