2) изменение рН (+)
3) вспышку света
4) флуоресцентную метку
Система Ion Torrent PGM использует полупроводниковое секвенирование методом синтеза. При включении комплементарного нуклеотида в растущую цепь ДНК высвобождается ион водорода (H+), что приводит к локальному изменению кислотности реакционной среды. Это изменение регистрируется ион-чувствительным полевым транзистором (ISFET), преобразующим химический сигнал в электрический.
Таким образом, детектируемым параметром является изменение pH, а не световой импульс или флуоресценция. Нуклеотиды подаются последовательно; если введённый тип нуклеотида комплементарен матрице, возникает электрический сигнал, интенсивность которого связана с числом одинаковых нуклеотидов, включённых подряд. Метод не требует флуоресцентных или радиоактивных меток, что упрощает оптическую систему прибора и ускоряет анализ.
Особое значение имеет интерпретация гомополимерных участков — последовательностей из нескольких одинаковых оснований подряд. При их удлинении формируется более сильный сигнал, однако количественная оценка таких сигналов может быть менее точной, поэтому ошибки преимущественно возникают при определении длины гомополимеров. Технология применяется для таргетного и панельного NGS-анализа, выявления однонуклеотидных вариантов, небольших вставок и делеций.
| Метод секвенирования | Регистрируемый сигнал | Необходимость метки | Ключевая особенность |
|---|---|---|---|
| Ion Torrent PGM | Изменение концентрации H+ и pH | Не требуется | Полупроводниковая регистрация химического сигнала ISFET |
| Секвенирование по Сэнгеру | Флуоресцентный сигнал от фрагментов разной длины | Требуется флуоресцентная метка | Высокая точность при анализе отдельных ампликонов, ограниченная пропускная способность |
| Illumina | Флуоресценция при включении меченого нуклеотида | Требуется флуоресцентная метка | Высокая точность и массовый параллельный анализ коротких прочтений |
| Пиросеквенирование | Свет, возникающий через каскад ферментативных реакций | Нуклеотиды обычно не флуоресцентно мечены | Регистрация люминесценции; возможны ограничения при гомополимерах |
| Нанопоровое секвенирование | Изменение ионного тока при прохождении ДНК через нанопору | Не требуется | Прямое считывание длинных молекул и получение длинных прочтений |
| Радиоактивное секвенирование | Радиоактивность меченых фрагментов | Требуется радиоактивная метка | Исторический подход, практически вытесненный безопасными нерадиоактивными технологиями |
Изменение pH является непосредственным следствием химии включения нуклеотида и служит диагностическим сигналом для каждого кластера или микролунки. Преобразование химической реакции в электрический импульс отличает Ion Torrent PGM от оптических платформ. Отсутствие меток снижает сложность детектирующей системы и расход реагентов. При оценке результатов необходимо учитывать возможную неопределённость длины гомополимерных последовательностей.