2) секвенирование ДНК
3) электрофорез
4) анализ микросателлитного полиморфизма (+)
Анализ микросателлитного полиморфизма относится к косвенной ДНК-диагностике, поскольку позволяет установить не саму патогенную мутацию, а наследование хромосомного участка, генетически сцепленного с локусом заболевания. Микросателлиты представляют собой короткие тандемные повторы ДНК, число которых варьирует у разных людей; такие участки выполняют функцию высокополиморфных генетических маркеров.
В исследовании определяют аллели микросателлитных маркеров у больного и родственников, строят гаплотипы и оценивают их совместное наследование с заболеванием в семье. Обычно фрагмент маркера амплифицируют методом ПЦР, а различия по длине продуктов выявляют капиллярным электрофорезом. Если определённый аллель или гаплотип устойчиво передаётся вместе с заболеванием, носительство соответствующего хромосомного участка расценивают как косвенное свидетельство наличия патологического варианта в сцепленном гене.
В отличие от этого, секвенирование непосредственно устанавливает нуклеотидную последовательность и выявляет конкретные варианты, а анализ однонитевого конформационного полиморфизма служит методом скрининга изменений последовательности по различию электрофоретической подвижности одноцепочечных фрагментов. Электрофорез сам по себе является методическим этапом разделения молекул, а не самостоятельным видом косвенной ДНК-диагностики. Надёжность сцепленного анализа зависит от информативности маркера, достаточного числа обследованных родственников и отсутствия рекомбинации между маркером и геном заболевания.
| Подход | Что исследуется | Принцип выявления | Характер диагностики |
|---|---|---|---|
| Микросателлитный анализ | Вариабельное число коротких тандемных повторов | Сопоставление длины аллелей и их наследования в семье | Косвенная диагностика по сцеплению с патологическим локусом |
| SNP-маркерный анализ | Однонуклеотидные полиморфизмы вблизи гена | Определение гаплотипа, совместно наследуемого с заболеванием | Косвенный метод при подтверждённом семейном сцеплении |
| Секвенирование ДНК | Нуклеотидная последовательность гена или панели генов | Прямое чтение последовательности и поиск патогенного варианта | Прямая молекулярно-генетическая диагностика |
| Однонитевой конформационный полиморфизм | Конформация одноцепочечных фрагментов ДНК | Различие электрофоретической подвижности фрагментов при изменении последовательности | Скрининговое выявление возможной мутации, обычно с последующим секвенированием |
| Электрофорез | Фрагменты ДНК, разделяемые по размеру и заряду | Миграция молекул в электрическом поле | Лабораторная технология, а не самостоятельный тип ДНК-диагностики |
| ПЦР-RFLP | Участок ДНК с известным вариантом, изменяющим сайт рестрикции | Различие размеров фрагментов после рестрикции ампликона | Прямая диагностика известной мутации или аллеля |
Косвенный анализ особенно значим при заболеваниях с известным локусом, но неизвестной или технически труднодоступной мутацией. Для пренатальной диагностики и анализа носительства необходимо предварительно подтвердить информативность маркеров в конкретной семье. Возможная рекомбинация между маркером и геном может привести к ошибочной оценке, поэтому используют несколько маркеров, расположенных по обе стороны от исследуемого локуса. При наличии доступного и валидированного прямого теста результаты сцепленного анализа целесообразно дополнять прямым выявлением патогенного варианта.