2) деградации экзогенных микроРНК (+)
3) блокирования функций эндогенных микроРНК
4) определения уровня экспрессии микроРНК с помощью экспрессионных микрочипов
Правильный ответ — деградация экзогенных микроРНК. LNA (locked nucleic acid) — это химически стабилизированный аналог нуклеотида с фиксированной конформацией рибозы, что повышает аффинность и термическую стабильность дуплекса с комплементарной РНК. Благодаря этому LNA-зонды эффективно распознают короткие зрелые микроРНК и различают близкородственные последовательности, включая варианты, отличающиеся одним нуклеотидом.
В гибридизации in situ LNA-зонды, как правило меченные флуорофором или другим репортером, выявляют пространственное распределение микроРНК в клетках и тканях. В функциональных исследованиях комплементарные LNA-антисмысловые олигонуклеотиды, или anti-miR, связывают зрелую эндогенную микроРНК и препятствуют её включению в регуляцию целевых транскриптов. На экспрессионных микрочипах LNA-последовательности используют как иммобилизованные захватывающие зонды: интенсивность гибридизационного сигнала отражает относительное содержание соответствующей микроРНК.
Прямая деградация экзогенно введённой микроРНК не является типичным назначением полностью LNA-модифицированного олигонуклеотида. В такой конфигурации он преимущественно стабильно связывает микроРНК и блокирует её биологическую активность, но не инициирует её разрушение. Для деградации РНК необходимы другие механизмы, например РНКаза H-зависимые gapmer-конструкции с центральным ДНК-участком; это специальный дизайн антисмыслового препарата, а не стандартный LNA-зонд или anti-miR.
| Задача | Тип LNA-конструкции | Основной механизм | Результат |
|---|---|---|---|
| Гибридизация in situ | Меченый LNA-зонд | Высокоаффинное комплементарное связывание с микроРНК в фиксированной клетке или ткани | Визуализация локализации и распределения микроРНК |
| Ингибирование эндогенной микроРНК | Антисмысловой anti-miR | Секвестрация зрелой микроРНК и блокирование её взаимодействия с мРНК-мишенью | Снижение функционального эффекта микроРНК без обязательного разрушения её молекулы |
| Профилирование экспрессии | Иммобилизованные LNA-захватывающие зонды микрочипа | Гибридизация меченого образца с последовательностями, комплементарными определённым микроРНК | Оценка относительного уровня экспрессии микроРНК по интенсивности сигнала |
| Прямая деградация экзогенной микроРНК | Обычный полностью LNA-модифицированный олигонуклеотид | Стабильное связывание без обязательного привлечения РНКазы H | Не является стандартным применением; преимущественно достигается функциональная блокада |
| РНКаза H-зависимое разрушение РНК | Gapmer: LNA-фланкирующие участки и центральный ДНК-участок | Формирование ДНК–РНК-гибрида с последующей активацией РНКазы H | Возможна деградация РНК-мишени при специально подобранной конструкции |
| Контроль специфичности эксперимента | Scrambled- и mismatch-LNA-олигонуклеотиды | Оценка неспецифического связывания и эффектов химической модификации | Подтверждение, что наблюдаемый эффект обусловлен конкретной микроРНК |
Таким образом, ключевой принцип применения LNA в исследованиях микроРНК — высокоспецифичная гибридизация, а не универсальная нуклеазная деградация. При интерпретации эксперимента необходимо различать снижение активности микроРНК вследствие её секвестрации и фактическое уменьшение её количества. Подтверждение результата обычно включает количественную ПЦР, анализ экспрессии мРНК-мишени и соответствующие неспецифические контроли. Выбор LNA-зонда или gapmer-конструкции определяется тем, требуется ли обнаружение, блокирование функции или разрушение РНК-мишени.