2) лунки
3) катода
4) анода (+)
Нуклеиновые кислоты имеют суммарный отрицательный заряд благодаря фосфатным группам сахарофосфатного остова. При помещении образца в электрическое поле молекулы ДНК или РНК отталкиваются от отрицательно заряженного катода и перемещаются к положительно заряженному электроду — аноду. Лунки в геле поэтому располагают со стороны катода, чтобы исследуемый материал проходил через толщу гелевой матрицы в требуемом направлении.
Гель выполняет роль молекулярного сита: короткие фрагменты нуклеиновой кислоты преодолевают его поры быстрее и мигрируют дальше, чем длинные. Скорость разделения также зависит от концентрации геля, напряжённости электрического поля, состава буферного раствора и пространственной конформации молекул. После электрофореза положение фрагментов оценивают относительно маркера молекулярной массы, что позволяет определить их приблизительный размер.
| Параметр | Характеристика | Влияние на электрофорез |
|---|---|---|
| Заряд нуклеиновой кислоты | Отрицательный из-за фосфатных групп | Обеспечивает движение к аноду |
| Анод | Положительно заряженный электрод | Является направлением миграции ДНК и РНК |
| Катод | Отрицательно заряженный электрод | Располагается со стороны лунок и отталкивает молекулы |
| Размер фрагмента | Определяется числом пар нуклеотидов | Малые фрагменты мигрируют быстрее и дальше |
| Концентрация геля | Определяет размер пор гелевой матрицы | Высокая концентрация улучшает разделение коротких фрагментов |
| Буферный раствор | Поддерживает pH и проводимость среды | Обеспечивает стабильное электрическое поле и сохранность образца |
| Маркер длины | Набор фрагментов известного размера | Используется для оценки длины исследуемых фрагментов |
Направление миграции является обязательным условием правильной установки электрофоретической камеры. При обратном подключении электродов образец выходит из лунок в буфер и утрачивается, не проходя через гель. В агарозном геле обычно разделяют сравнительно крупные фрагменты ДНК и РНК, а полиакриламидный гель применяют для более точного анализа коротких фрагментов. Электрофорез используется в молекулярно-генетической диагностике для контроля продуктов ПЦР, генотипирования и анализа рестрикционных фрагментов.