2) ионообменной
3) адсорбционной
4) аффинной (+)
Аффинная хроматография основана на высокоспецифическом, обычно обратимом взаимодействии разделяемой макромолекулы с иммобилизованным лигандом. Лиганд фиксируют на инертной матрице; им может быть субстрат или ингибитор фермента, антиген или антитело, рецептор, фрагмент нуклеиновой кислоты либо другой молекулярный партнер. Благодаря принципу лиганд — мишень нужный белок избирательно удерживается в колонке, тогда как большинство примесей удаляется при промывании.
После нанесения образца целевую молекулу элюируют, то есть переводят в раствор, разрушая комплекс с лигандом. Для этого применяют конкурентный элюент, изменение pH или ионной силы буфера, а в некоторых системах — мягкие денатурирующие условия. Метод позволяет получать высокоочищенные белки, ферменты, иммуноглобулины и рецепторные молекулы, иногда за одну стадию, что особенно важно при выделении биологически активных препаратов.
Ионообменная хроматография разделяет вещества преимущественно по заряду, адсорбционная — по различиям неспецифического взаимодействия с поверхностью сорбента, а газо-жидкостная применяется главным образом к летучим и термостабильным низкомолекулярным соединениям. Поэтому именно аффинный принцип соответствует разделению макромолекул по их биологической специфичности. Частным вариантом является иммуноаффинная хроматография, где избирательность обеспечивается реакцией антиген–антитело.
| Метод | Основной принцип разделения | Тип взаимодействия | Характеристика и применение |
|---|---|---|---|
| Аффинная | Специфическое связывание молекулы с иммобилизованным лигандом | Лиганд–мишень: антиген–антитело, фермент–субстрат, рецептор–лиганд | Высокоселективная очистка белков, ферментов, антител и других биомакромолекул |
| Иммуноаффинная | Избирательное удерживание антигена специфическим антителом | Антиген–антитело | Выделение и концентрирование антигенов, гормонов, токсинов и диагностических маркеров |
| Ионообменная | Различия в суммарном электрическом заряде молекул | Электростатическое взаимодействие с заряженной смолой | Эффективна для фракционирования белков при контроле pH и ионной силы буфера |
| Адсорбционная | Различия в способности компонентов удерживаться на поверхности сорбента | Преимущественно неспецифические поверхностные взаимодействия | Применяется для разделения веществ по полярности, гидрофобности и сродству к сорбенту |
| Гель-фильтрационная | Различия в гидродинамическом размере молекул | Стерическое проникновение в поры геля | Крупные молекулы элюируются раньше мелких; используется также для определения агрегатов и молекулярной массы |
| Газо-жидкостная | Различия в летучести и распределении между газовой и жидкой фазами | Физико-химическое распределение при нагревании | Подходит главным образом для летучих термостабильных соединений, а не для большинства белков |
Ключевым диагностическим признаком аффинного метода является наличие заранее известной пары специфического связывания между целевой молекулой и лигандом. Селективность определяется не только физико-химическими свойствами вещества, но и сохранением его пространственной структуры и активного центра. Эффективность очистки оценивают по выходу, степени чистоты и сохранению биологической активности выделенного компонента. Чем выше специфичность взаимодействия, тем меньше число последующих стадий фракционирования.