2) дистиллированной воды
3) этанола раствора 10%
4) азотной кислоты раствора 1% (+)
Фиксация нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле проводится кратковременной обработкой 1% раствором азотной кислоты. Кислая среда изменяет степень ионизации функциональных групп нуклеиновых кислот, уменьшает их растворимость и диффузию в гелевой матрице, благодаря чему электрофоретические зоны сохраняют исходное положение. Одновременно удаляются часть низкомолекулярных примесей и компонентов буфера, способных повышать фон при последующем окрашивании.
Этот этап особенно важен перед серебряным окрашиванием. После фиксации ионов серебра связываются с участками нуклеиновых кислот, преимущественно с фосфатными группами и азотистыми основаниями, а при проявлении восстанавливаются до металлического серебра; в результате полосы ДНК или РНК становятся видимыми. Таким образом, азотная кислота выполняет функцию фиксатора, а нитрат серебра — функцию выявляющего, или окрашивающего, реагента.
Дистиллированная вода применяется главным образом для отмывания геля, а 10% этанол может использоваться в отдельных спиртовых или комбинированных протоколах фиксации, но не является специфическим ответом для данного метода. Кратковременность и стандартизация кислотной обработки необходимы, поскольку чрезмерно длительное воздействие сильной кислоты может привести к повреждению или гидролизу нуклеиновых кислот и ухудшению качества зон.
| Этап или реагент | Основная функция | Практический результат |
|---|---|---|
| 1% раствор азотной кислоты | Кислотная фиксация нуклеиновых кислот в полиакриламидной матрице | Предотвращение диффузии фрагментов и сохранение положения электрофоретических полос |
| Нитрат серебра | Связывание ионов серебра с компонентами нуклеиновых кислот | Подготовка зон к восстановлению и формированию видимого окрашивания |
| Проявитель, обычно щелочной раствор с восстановителем | Восстановление Ag+ до металлического серебра | Появление темных полос ДНК или РНК на прозрачном фоне геля |
| Дистиллированная вода | Промывание геля и удаление избытка реагентов | Снижение неспецифического фона и прекращение действия предыдущего раствора |
| 10% этанол | Дегидратация и возможная спиртовая фиксация в альтернативных протоколах | Может способствовать осаждению биополимеров, но не заменяет специфическую кислотную фиксацию в данном методе |
| Недостаточная фиксация | Неполное удержание нуклеиновых кислот в геле | Размытые полосы, потеря материала при промывании и сниженная чувствительность анализа |
| Чрезмерная кислотная обработка | Избыточное воздействие низкого pH на биополимеры | Риск гидролиза нуклеиновых кислот, повышения фона и искажения интенсивности полос |
Надежность результата определяется точным соблюдением концентрации раствора, времени фиксации и чистоты посуды. Особое значение имеет отсутствие хлорид-ионов, поскольку они могут образовывать с ионами серебра хлорид серебра и повышать неспецифический фон. В судебно-экспертной практике стандартизация этих этапов необходима для сопоставимости профилей и корректной оценки различий в интенсивности электрофоретических зон.