2) определения зависимости электрофоретической подвижности фрагментов от их размеров
3) разделения STR-маркеров с перекрывающимися размерными диапазонами (+)
4) определения величины электрофоретической подвижности гетерологичных стандартов молекулярных масс
Флуоресцентные красители в мультиплексной ПЦР наносят на праймеры, амплифицирующие различные STR-локусы. Каждый краситель имеет собственный спектр эмиссии, поэтому продукты реакции, разделённые капиллярным электрофорезом, регистрируются в разных спектральных каналах. Это позволяет одновременно исследовать множество локусов и различать ампликоны, длина которых одинакова или находится в перекрывающихся размерных диапазонах.
В основе метода лежит комбинация двух независимых признаков: длина фрагмента определяет его электрофоретическую миграцию, а цвет флуоресцентной метки указывает на принадлежность к определённому локусу или группе локусов. Поэтому фрагменты сходного размера, которые невозможно надёжно идентифицировать только по положению пика, разделяются по спектральному сигналу. Именно это обеспечивает корректное типирование STR-профиля при мультиплексном анализе.
Флуоресцентное мечение не предназначено для устранения ингибирования ПЦР и не определяет непосредственно электрофоретическую подвижность. Контроль размеров выполняется с помощью аллельных лестниц и внутреннего флуоресцентно меченного стандарта с фрагментами известной длины; красители обеспечивают многоканальную регистрацию и разграничение сигналов.
| Компонент или признак | Механизм | Значение для STR-анализа |
|---|---|---|
| Флуоресцентно меченый праймер | Встраивает метку в амплифицированный фрагмент | Позволяет обнаружить продукт ПЦР и определить его спектральный канал |
| Разные флуорофоры | Имеют различающиеся спектры возбуждения и эмиссии | Обеспечивают независимое распознавание ампликонов разных локусов |
| Перекрывающиеся размерные диапазоны | Фрагменты близкой или одинаковой длины могут мигрировать в одной области электрофореграммы | Различаются по цвету сигнала, что предотвращает ошибочную атрибуцию локуса |
| Капиллярный электрофорез | Разделяет фрагменты преимущественно по длине; более короткие фрагменты мигрируют быстрее | Формирует пики, по которым оценивают размер и интенсивность аллелей |
| Внутренний размерный стандарт | Содержит фрагменты известной длины и также регистрируется флуоресцентно | Обеспечивает калибровку шкалы размеров каждой электрофореграммы |
| Ингибиторы ПЦР | Нарушают активность полимеразы или доступность матрицы | Устраняются отдельными методами очистки, разведением или оптимизацией реакции, а не флуоресцентным м标ированием |
При интерпретации результатов учитывают спектральную калибровку прибора, порог аналитического сигнала, возможные артефакты и пики stutter. Перекрёстное влияние каналов, включая артефакт pull-up , может имитировать слабый дополнительный аллель и требует инструментального контроля. Достоверность профиля подтверждают сопоставлением с аллельной лестницей, внутренним стандартом и правилами валидации конкретной тест-системы.