2) анализа
3) амплификации (+)
4) элюции
Контрольный образец включают именно на этапе амплификации, поскольку в этот момент оценивается работоспособность полимеразной цепной реакции (ПЦР) и отсутствие ингибирования. В судебно-генетическом исследовании контроль обычно содержит ДНК с заранее известным профилем либо представляет собой реакцию без матрицы. Положительный контроль должен дать ожидаемый амплификационный продукт и соответствующий аллельный профиль, а отрицательный — не содержать специфического сигнала.
Такой контроль позволяет одновременно выявить неэффективность праймеров, нарушение температурного режима, дефекты реагентов и контаминацию лабораторного пространства или образцов чужой ДНК. Если положительный контроль не амплифицировался, отрицательный результат исследуемого образца недостоверен; появление сигнала в отрицательном контроле указывает на загрязнение и требует повторения постановки. На этапе элюции контролируют извлечение ДНК из сорбента, а на этапе детекции оценивают регистрацию уже полученного продукта, поэтому эти этапы не заменяют контроля самой амплификации.
| Вид контроля | Состав | Что оценивает | Интерпретация результата |
|---|---|---|---|
| Положительный контроль амплификации | ДНК с известным генотипом или целевой последовательностью | Работоспособность праймеров, полимеразы, буфера и термоциклирования | Ожидаемый профиль подтверждает корректность реакции |
| Отрицательный контроль амплификации | Реакционная смесь без матричной ДНК, обычно с молекулярно чистой водой | Отсутствие контаминации реагентов и рабочих поверхностей | Специфический сигнал должен отсутствовать |
| Контроль экстракции | Проба без биологического материала, проходящая весь процесс выделения ДНК | Загрязнение на стадиях лизиса, очистки и элюции | Сигнал свидетельствует о контаминации до постановки ПЦР |
| Внутренний контроль амплификации | Неспецифическая или отдельная контрольная мишень, добавленная в реакцию | Наличие ингибиторов и пригодность образца для ПЦР | Отсутствие контрольного сигнала при отрицательной мишени может означать ингибирование |
| Исследуемый образец | Выделенная ДНК из вещественного доказательства или сравнительного образца | Наличие и характеристики искомых генетических маркеров | Результат учитывается только при валидных контролях серии |
| Детекция амплификата | Электрофорез, капиллярный электрофорез или флуоресцентная регистрация | Размер, интенсивность и принадлежность полученных продуктов | Не заменяет контроля правильности самой ПЦР |
Амплификационные контроли являются обязательной частью аналитической серии и обеспечивают её внутреннюю валидность. В анализе STR-маркеров это особенно важно, поскольку даже единичная контаминация может привести к появлению ложных аллелей и ошибочной интерпретации генетического профиля. Результаты образцов допускаются к экспертной оценке только при соответствии контрольных реакций установленным критериям качества. При нарушении контроля постановку обычно повторяют с использованием новых реагентов и, при необходимости, повторно выделенной ДНК.