2) разрушения мембран клеток и ядер (+)
3) элюции ДНК
4) очистки ДНК от примесей
Лизирующий буфер используют на начальном этапе выделения ДНК из биологического материала. Его детергенты (например, SDS, Triton X-100 или другие поверхностно-активные вещества) нарушают липидный бислой плазматической и ядерной мембран, вследствие чего клеточное содержимое и ядерная ДНК переходят в раствор. В составе буфера также могут присутствовать соли, стабилизирующие компоненты и хелатор EDTA, связывающий ионы магния и кальция, необходимые для работы нуклеаз.
Лизис не равнозначен полной очистке ДНК. Протеиназа K, которую часто добавляют к лизирующей смеси, расщепляет белки, включая гистоны и белки клеточных структур, однако удаление продуктов распада и других ингибиторов выполняется на последующих этапах. Поэтому назначение лизирующего буфера — прежде всего разрушение клеточных и ядерных оболочек и высвобождение нуклеиновой кислоты, что соответствует отмеченному ответу.
Элюция представляет собой обратное высвобождение ДНК с сорбента в малом объёме буфера, а очистка включает удаление белков, солей, детергентов, гемоглобина и иных ингибиторов амплификации. Эти операции нельзя смешивать с первичным лизисом, поскольку они относятся к разным стадиям пробоподготовки.
| Компонент или этап | Основное действие | Результат |
|---|---|---|
| Детергент лизирующего буфера | Растворяет липидные мембраны и нарушает межмолекулярные взаимодействия в мембранных комплексах | Разрушение клеточной и ядерной оболочек, высвобождение ДНК |
| EDTA | Хелатирует двухвалентные катионы, необходимые для активности ДНКаз | Снижение риска ферментативной деградации ДНК |
| Tris-HCl | Поддерживает стабильный слабощелочной pH раствора | Сохранение химической стабильности ДНК в процессе выделения |
| Протеиназа K | Гидролизует белки, включая гистоны и белки ядерного матрикса | Освобождение ДНК от белковых комплексов; частичная деградация белковых примесей |
| Хаотропные соли и буфер связывания | Денатурируют макромолекулы и создают условия для адсорбции ДНК на силикагеле или магнитных частицах | Перевод ДНК на твёрдую фазу для последующей очистки |
| Промывочный буфер | Удаляет соли, детергенты, остаточные белки и другие ингибиторы | Повышение чистоты выделенной ДНК |
| Элюирующий буфер | Изменяет ионные условия и гидратирует ДНК, ослабляя её связь с сорбентом | Получение очищенной ДНК в растворе |
Недостаточный лизис приводит к неполному высвобождению ДНК и снижению аналитической чувствительности исследования, особенно при работе с малым количеством клеток. В судебно-биологическом анализе качество лизиса влияет на возможность последующей амплификации STR-маркеров и получение полного генетического профиля. Таким образом, лизирующий буфер обеспечивает доступ к внутриклеточной и ядерной ДНК, но не заменяет процедуры очистки и элюции.