2) гидродинамический
3) электрокинетический (+)
4) гидростатический
В генетических анализаторах продукты ПЦР вводятся в разделительный капилляр преимущественно электрокинетически: между электродом в пробе и электродом на выходе капилляра прикладывается высокое напряжение, создающее электрическое поле. ДНК имеет отрицательный заряд благодаря фосфатным группам, поэтому ее молекулы направленно мигрируют к положительно заряженному электроду и перемещаются через капиллярную инъекционную зону. Кратковременная подача напряжения обеспечивает дозированный ввод флуоресцентно меченных ампликонов или фрагментов, полученных при секвенировании.
После инжекции фрагменты разделяются в капилляре, заполненном полимерным электролитом, по их электрофоретической подвижности, которая главным образом зависит от длины молекул. На процесс также влияет электроосмотический поток — движение раствора относительно заряженной стенки капилляра, однако непосредственное привнесение ДНК в капилляр определяется действием электрического поля на заряженные молекулы, то есть электрокинетическим механизмом. Поэтому пневматическое, гидродинамическое или гидростатическое введение не является стандартным механизмом инжекции в классических системах капиллярного генетического анализа.
Объем и состав вводимой пробы зависят от напряжения и продолжительности инжекции, концентрации ДНК, ионной силы и электропроводности раствора. Избыточное содержание солей может изменять распределение электрического поля и снижать эффективность ввода, а слишком высокая концентрация ампликонов приводит к перегрузке сигнала и ухудшению разделения. Эти особенности имеют значение при интерпретации электрофореграмм, в том числе при анализе ДНК-профилей в судебно-генетических исследованиях.
| Механизм | Движущая сила | Что перемещается в капилляр | Типичное применение | Основные факторы, влияющие на ввод |
|---|---|---|---|---|
| Электрокинетический | Электрическое поле и разность потенциалов | Заряженные молекулы ДНК, преимущественно анионы | Стандартная инжекция в капиллярных генетических анализаторах | Напряжение, время инжекции, концентрация ДНК, ионная сила и проводимость образца |
| Гидродинамический | Перепад давления между концами капилляра | Раствор вместе с содержащимися в нем аналитами | Некоторые системы капиллярного электрофореза и автоматические анализаторы | Давление, время подачи, вязкость и гидродинамическое сопротивление |
| Гидростатический | Разность уровней жидкости в резервуарах | Раствор под действием силы тяжести | Специальные или экспериментальные схемы ввода | Высота столбов жидкости, плотность и вязкость раствора |
| Пневматический | Давление газа на поверхность образца | Проба, вытесняемая газом в канал | Не является типичным механизмом ввода ДНК в стандартный генетический анализатор | Давление газа, герметичность системы, объем вытеснения |
| Электроосмотический поток | Движение жидкой фазы вдоль заряженной стенки капилляра | Раствор в целом, а не только молекулы ДНК | Влияет на скорость и профиль миграции при капиллярном электрофорезе | Материал капилляра, pH, ионный состав буфера и поверхностный заряд |
| Электрофоретическая миграция ДНК | Сила, действующая на отрицательно заряженный фосфатный остов ДНК | Ампликоны и другие фрагменты нуклеиновых кислот | Формирует направленное перемещение и последующее разделение фрагментов | Размер фрагмента, заряд, напряженность поля и свойства полимерной матрицы |
Электрокинетическая инжекция обеспечивает совместимость ввода с последующим капиллярным электрофорезом и позволяет получать воспроизводимые флуоресцентные профили. В судебной генетике это важно для корректного определения аллелей STR-маркеров и оценки качества ДНК-профиля. Нарушения режима инжекции проявляются изменением интенсивности пиков, дисбалансом аллелей и появлением артефактов электрофореграммы. Таким образом, правильный ответ основан на заряде молекул ДНК и их направленном движении в электрическом поле.Учебный курс: тесты с ответами для судебного эксперта.