2) чистоты процесса постановки реакции амплификации ДНК
3) чистоты процесса проведения электрофореза
4) достоверности установления аллелей исследуемых объектов
Отрицательный контроль выделения ДНК представляет собой пробу, которую проводят через те же этапы лизиса, очистки и элюирования, что и исследуемые образцы, но без внесения биологического материала. Он предназначен для выявления посторонней ДНК, попавшей из реагентов, одноразовых расходных материалов, оборудования, воздуха или соседних образцов в процессе экстракции. Поэтому его результат характеризует чистоту процедуры выделения и позволяет повысить достоверность последующего исследования генетических маркеров.
При корректной постановке отрицательный контроль не должен содержать амплифицируемой ДНК и, соответственно, не должен давать специфического сигнала при последующей ПЦР. Обнаружение пиков или иного значимого амплификационного продукта в такой пробе свидетельствует о возможной контаминации партии; результаты соответствующего этапа требуют оценки, установления источника загрязнения и, как правило, повторного исследования. Это особенно важно при анализе следовых количеств биологического материала, когда даже небольшая примесь может сформировать ложный генетический профиль или исказить профиль исследуемого объекта.
Отрицательный контроль выделения не заменяет контрольные образцы, применяемые на других этапах. Контроль постановки амплификации выявляет загрязнение, внесённое уже в реакционную смесь после экстракции, а аллельный маркер и внутренний стандарт размеров оценивают корректность генотипирования и электрофоретического разделения. Следовательно, его основная диагностическая задача — контроль чистоты экстракции ДНК и связанных с ней манипуляций, а не непосредственная проверка электрофореза или правильности присвоения аллелей.
| Контроль или элемент исследования | Состав и этап применения | Что контролирует | Значение положительного или отрицательного результата |
|---|---|---|---|
| Отрицательный контроль выделения | Реагенты и расходные материалы проходят процедуру экстракции без биологического материала | Контаминацию на этапах лизиса, очистки, элюирования и первичной подготовки ДНК | Отсутствие специфического сигнала подтверждает чистоту партии; сигнал требует расследования и оценки достоверности серии |
| Отрицательный контроль амплификации | ПЦР-смесь без матричной ДНК, обычно с добавлением элюента или воды | Загрязнение реактивов, рабочего места или инструментов непосредственно при постановке ПЦР | Амплификационный сигнал указывает на контаминацию реакционной смеси, но не локализует её на этапе экстракции |
| Положительный контроль амплификации | Образец с известной ДНК и заранее определённым профилем или целевой последовательностью | Работоспособность реагентов, термоциклера и компонентов реакции | Ожидаемый сигнал подтверждает техническую состоятельность ПЦР; отсутствие сигнала указывает на возможный ингибитор или сбой реакции |
| Аллельный лестничный стандарт | Набор фрагментов с известными аллелями исследуемых STR-маркеров | Корректность отнесения пиков образца к конкретным аллелям | Используется для генотипирования, но не выявляет загрязнение на этапе выделения ДНК |
| Внутренний стандарт размеров | Фрагменты ДНК известной длины, добавляемые в электрофоретическую пробу | Калибровку размеров фрагментов и качество разделения при капиллярном электрофорезе | Нарушение миграции или отсутствие стандарта делает оценку размеров и аллелей ненадёжной |
| Повторное или независимое исследование | Повторная амплификация, экстракция или анализ другим оператором либо из отдельной аликвоты | Воспроизводимость генетического профиля и устойчивость результата к случайным артефактам | Совпадение результатов усиливает доказательность; расхождение требует проверки качества образца и этапов исследования |
Отсутствие сигнала в отрицательном контроле является необходимым, но не единственным условием валидности судебно-генетического исследования. Оценка результатов должна учитывать одновременно отрицательные и положительные контроли, качество электрофореграммы и воспроизводимость профиля. При выявлении загрязнения нельзя автоматически интерпретировать совпадение аллелей как принадлежность биологического следа конкретному лицу. Решение о приемлемости серии принимают после документированной проверки всех этапов лабораторного процесса.