2) увеличению специфичности процесса ПЦР
3) автоматизации процесса ПЦР (+)
4) ускорению фазы достраивания в циклах ПЦР
Термостабильная Taq-полимераза сохраняет каталитическую активность после многократного нагревания реакционной смеси до 94–98 °C, необходимого для денатурации двуцепочечной ДНК. Благодаря этому фермент не требуется добавлять заново после каждого температурного цикла, как это происходило при использовании термолабильных ДНК-полимераз.
Устойчивость фермента к нагреванию позволила выполнять последовательные стадии денатурации, отжига праймеров и элонгации в программируемом термоциклере без вмешательства оператора. Именно поэтому внедрение Taq-полимеразы стало ключевым условием автоматизации ПЦР и обеспечило воспроизводимое проведение десятков циклов амплификации в одной закрытой пробирке.
Повышенная температура денатурации является обязательным этапом самой ПЦР и не возникла вследствие применения Taq-полимеразы. Специфичность реакции преимущественно определяется последовательностью праймеров, температурой их отжига, концентрацией ионов магния и использованием технологии hot-start; термостабильность обычной Taq-полимеразы сама по себе не гарантирует специфичность. Скорость достраивания цепи зависит от кинетических свойств фермента и условий реакции, но автоматизация, а не ускорение элонгации, стала главным результатом его внедрения.
| Фактор или этап | Значение для ПЦР | Связь с Taq-полимеразой |
|---|---|---|
| Денатурация ДНК | Разделение двуцепочечной ДНК на одноцепочечные матрицы при 94–98 °C | Фермент переносит нагревание и сохраняется для следующего цикла |
| Отжиг праймеров | Связывание праймеров с комплементарными участками матрицы | Специфичность определяется прежде всего температурой отжига и структурой праймеров |
| Элонгация | Синтез новой цепи ДНК от 3′-конца праймера | Taq-полимераза наиболее активна приблизительно при 72 °C |
| Повторение циклов | Обеспечивает экспоненциальное накопление целевого фрагмента | Не требует повторного внесения фермента после денатурации |
| Автоматизация | Программируемая смена температур без ручных манипуляций | Стала возможной благодаря термостабильности фермента |
| Контроль специфичности | Снижение образования неспецифических ампликонов и димеров праймеров | Достигается оптимизацией условий и применением hot-start-модификаций |
Taq-полимераза была выделена из термофильной бактерии Thermus aquaticus, приспособленной к существованию при высоких температурах. Применение этого фермента сделало ПЦР технологически простой, воспроизводимой и пригодной для массового лабораторного использования. В судебно-экспертной практике автоматизированная амплификация позволяет исследовать малые количества ДНК, содержащиеся в биологических следах. При интерпретации результатов необходимо учитывать риск контаминации и ограничения Taq-полимеразы, включая отсутствие корректирующей 3′→5′-экзонуклеазной активности.