2) полиморфизма длин амплифицированных фрагментов
3) ПЦР в реальном времени
4) полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
Секвенирование по Сэнгеру считается классическим золотым стандартом при исследовании митохондриальной ДНК, поскольку позволяет непосредственно установить порядок нуклеотидов в анализируемом участке. В судебно-генетической практике обычно исследуют гипервариабельные области контрольного региона митохондриального генома (HV1, HV2, HV3), а при необходимости — полную митохондриальную последовательность. Метод выявляет точечные замены и небольшие делеции или вставки, по которым формируется митохондриальный гаплотип и проводится сравнение с образцами родственников по материнской линии либо с референсными базами данных.
Высокая точность прочтения электрофореграммы, воспроизводимость и возможность документировать конкретную нуклеотидную замену обусловливают диагностическую и идентификационную ценность метода. ПЦР в реальном времени предназначена главным образом для количественного определения ДНК и оценки пригодности образца, но не даёт полной информации о последовательности. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов зависит от наличия определённых сайтов рестрикции, а полиморфизм длин амплифицированных фрагментов характеризует размер продуктов, но не позволяет непосредственно определить нуклеотидный состав; поэтому оба подхода имеют более ограниченную разрешающую способность.
| Метод или подход | Основной принцип | Результат | Значение при анализе митохондриальной ДНК |
|---|---|---|---|
| Секвенирование по Сэнгеру | Терминация цепи флуоресцентно меченными дидезоксинуклеотидами с последующим капиллярным электрофорезом | Прямая нуклеотидная последовательность участка | Высокоточное определение гаплотипа, выявление замен и коротких инделов; классический референсный метод |
| ПЦР в реальном времени | Регистрация флуоресценции в процессе амплификации целевого фрагмента | Количество копий или относительная концентрация ДНК | Оценка количества митохондриальной ДНК, контроль амплификации и пригодности образца; последовательность обычно не определяется |
| Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов | Расщепление ампликона рестриктазами с последующим разделением фрагментов | Набор фрагментов различной длины | Выявляются только варианты, изменяющие сайты рестрикции; часть нуклеотидных замен остаётся нераспознанной |
| Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов | Сравнение размеров продуктов амплификации, полученных с различными праймерами или наборами праймеров | Профиль фрагментов по длине | Позволяет различать фрагментарные профили, но не устанавливает точную последовательность нуклеотидов |
| Массивное параллельное секвенирование (NGS) | Одновременное чтение большого числа фрагментов ДНК | Множественные последовательности и их глубина покрытия | Подходит для полного митохондриального генома, обнаружения низкоуровневой гетероплазмии и смешанных профилей; технологически сложнее |
| Гетероплазмия | Одновременное присутствие в клетках двух и более вариантов митохондриальной ДНК | Смешанный сигнал на электрофореграмме или неоднородность прочтений | При низкой доле минорного варианта чувствительность Сэнгера ограничена, поэтому может потребоваться NGS или подтверждающее исследование |
Интерпретация результатов должна учитывать исследованный участок, референсную последовательность, качество хроматограммы и возможность контаминации. Совпадение митохондриального гаплотипа подтверждает совместимость образцов, но не обеспечивает индивидуализацию, поскольку одинаковые варианты могут встречаться у лиц одной материнской линии. При обнаружении смешанных сигналов необходимо дифференцировать истинную гетероплазмию, смесь биологических образцов и артефакты амплификации.