2) реакция связывания комплемента
3) иммуноферментный анализ (+)
4) реакция агглютинации
Иммуноферментный анализ применяется для количественного определения цитокинов благодаря высокой специфичности взаимодействия антигена с моноклональными антителами и достаточной аналитической чувствительности. Наиболее распространён сэндвич -вариант метода: исследуемый цитокин связывается с иммобилизованным захватывающим антителом, после чего к образовавшемуся комплексу присоединяется второе антитело, конъюгированное с ферментом.
После добавления субстрата фермент катализирует образование окрашенного продукта, оптическая плотность которого пропорциональна концентрации цитокина в образце. Количественный результат рассчитывают по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартов с известным содержанием исследуемого вещества. Метод позволяет определять интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухоли, хемокины и другие растворимые медиаторы иммунного ответа в сыворотке или плазме крови.
Реакции агглютинации и связывания комплемента преимущественно выявляют антитела или антигены по формированию видимых иммунных комплексов и не обеспечивают необходимой чувствительности для измерения низких концентраций большинства цитокинов. Радиальная иммунодиффузия также уступает иммуноферментному анализу по чувствительности и обычно применяется для определения белков, присутствующих в биологических жидкостях в значительно более высоких концентрациях.
| Метод | Определяемый показатель | Основной принцип | Значение для исследования цитокинов |
|---|---|---|---|
| Иммуноферментный анализ | Концентрация отдельного цитокина | Специфическое связывание с антителами и ферментативная регистрация сигнала | Стандартный чувствительный метод количественного определения |
| Мультиплексный иммунный анализ | Панель нескольких цитокинов | Использование микросфер или меток с различными спектральными характеристиками | Позволяет исследовать иммунный профиль при небольшом объёме образца |
| Проточная цитометрия | Внутриклеточные цитокины | Окрашивание клеток флуоресцентными антителами после фиксации и пермеабилизации | Определяет клетки-продуценты и особенности их функционального ответа |
| ПЦР с обратной транскрипцией | Матричная РНК цитокина | Амплификация комплементарной ДНК, полученной из РНК | Оценивает экспрессию гена, но не фактическую концентрацию белка в крови |
| Радиальная иммунодиффузия | Белки в сравнительно высокой концентрации | Диффузия антигена в геле с образованием кольца преципитации | Недостаточно чувствительна для большинства цитокинов |
| Реакция агглютинации | Антигены или антитела | Склеивание корпускулярных частиц иммунными комплексами | Не используется как основной количественный метод оценки цитокинов |
| Реакция связывания комплемента | Преимущественно специфические антитела | Фиксация комплемента комплексом антиген–антитело | Не обеспечивает прямого чувствительного измерения цитокинов |
При интерпретации результатов необходимо учитывать короткий период циркуляции цитокинов, время забора крови и активность воспалительного процесса. Концентрация медиаторов может изменяться под влиянием терапии, сопутствующих инфекций и особенностей хранения образца. Изолированное изменение одного показателя редко обладает абсолютной диагностической специфичностью, поэтому предпочтительна оценка комплекса клинических и лабораторных данных. Исследование цитокинового профиля особенно полезно для мониторинга иммуновоспалительных заболеваний и эффективности таргетной терапии.