2) метиленовый синий
3) раствор гидроксида калия
4) жидкую черную тушь (+)
Для визуализации капсулы Cryptococcus neoformans и Cryptococcus gattii в ликворе применяют жидкую черную тушь — метод негативного окрашивания. Частицы туши равномерно затемняют фон препарата, но не проникают в полисахаридную капсулу, поэтому вокруг округлой дрожжевой клетки формируется характерный светлый, оптически прозрачный ореол. Наличие такой зоны отторжения красителя при прямой микроскопии является диагностическим признаком капсулированных криптококков.
Капсула криптококка состоит преимущественно из полисахаридов и имеет выраженные антифагоцитарные свойства, что способствует выживанию возбудителя в центральной нервной системе. В нативном препарате ликвора на темном фоне выявляют крупные округлые или овальные дрожжевые клетки, иногда с узким основанием почкования; капсула выглядит как светлый ободок различной ширины. Метод особенно информативен при высокой концентрации возбудителя в ликворе, однако отрицательный результат не исключает криптококковый менингит.
Окраска по Граму может выявить дрожжевые клетки, но не предназначена для надежной демонстрации капсулы. Метиленовый синий окрашивает клеточные структуры, а раствор гидроксида калия используется главным образом для растворения клеточного детрита при поиске грибковых элементов и не создает специфической картины капсулы в ликворе. Поэтому именно негативное окрашивание тушью является классическим методом прямого обнаружения капсулы криптококка.
| Метод | Принцип | Типичный результат | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Черная тушь | Негативное окрашивание: частицы туши не проникают в капсулу | Светлый ореол вокруг дрожжевой клетки на темном фоне | Классический метод прямого выявления капсулы Cryptococcus |
| Окраска по Граму | Окрашивание клеточной стенки и цитоплазматических структур | Грамположительно окрашенные дрожжевые клетки, капсула выражена непостоянно | Может подтвердить наличие дрожжеподобных грибов, но не является оптимальной для оценки капсулы |
| Метиленовый синий | Контрастирование клеточных элементов препарата | Окрашенные клетки и фон без специфического капсульного ореола | Не используется как стандартный метод выявления капсулы криптококка |
| Раствор гидроксида калия | Лизис клеточного детрита и освобождение грибковых элементов | Гифы или дрожжевые клетки при наличии; капсула в ликворе оценивается ненадежно | Метод подготовки материала при микозах, но не специфический тест на криптококковую капсулу |
| Криптококковый антиген в ликворе | Иммунологическое выявление капсульного полисахрида | Положительный тест при наличии растворимого антигена возбудителя | Высокочувствительный метод подтверждения, особенно при малом количестве клеток в препарате |
| Культура ликвора | Выделение жизнеспособного возбудителя на питательной среде | Рост колоний Cryptococcus с последующей идентификацией | Подтверждает этиологию и позволяет провести видовую идентификацию и тестирование чувствительности |
Отрицательный результат микроскопии тушью возможен при низкой концентрации возбудителя, небольшой капсуле или технических погрешностях приготовления препарата. При подозрении на криптококковый менингит исследование дополняют определением криптококкового антигена, посевом и, при необходимости, молекулярными методами. Одновременно оценивают давление открытия ликвора, цитоз, содержание белка и глюкозы, поскольку криптококковая инфекция часто сопровождается повышением внутричерепного давления. Выявление капсулированных дрожжевых клеток в ликворе требует срочного клинико-лабораторного подтверждения и начала специализированной противогрибковой терапии.