2) ионообменная
3) газожидкостная
4) адсорбционная
Гель-фильтрационная, или эксклюзионная, хроматография разделяет белки по их гидродинамическому объёму. Неподвижная фаза представляет собой пористые гранулы геля: крупные молекулы не проникают в поры и проходят через колонку по межгранулярному пространству, поэтому элюируются первыми; более мелкие белки проникают внутрь пор и задерживаются дольше. Метод сохраняет нативную структуру белков и может применяться для очистки от агрегатов, фрагментов, низкомолекулярных примесей и для фракционирования белковых комплексов.
Для оценки молекулярной массы используют калибровку колонки стандартными белками с известной молекулярной массой. По объёму элюирования исследуемого белка и калибровочной зависимости, обычно выражаемой как связь между log M и коэффициентом распределения Kav, рассчитывают его кажущуюся молекулярную массу. Поскольку разделение определяется не только массой, но и формой молекулы, результат корректнее трактовать как оценку молекулярной массы в нативных условиях; для точного определения применяют масс-спектрометрию или электрофорез в денатурирующих условиях.
| Метод | Основной принцип разделения | Практическое значение для белков |
|---|---|---|
| Гель-фильтрационная | Различия в гидродинамическом объёме и доступности пор геля | Нативное разделение, очистка, оценка кажущейся молекулярной массы и олигомерного состояния |
| Ионообменная | Различия в суммарном заряде белков при заданном значении pH | Высокоэффективная очистка; элюирование изменением ионной силы или pH, но прямое определение массы не является целью метода |
| Адсорбционная | Различия в прочности взаимодействия белка с поверхностью сорбента | Разделение по поверхностным свойствам; возможна денатурация при слишком сильной сорбции |
| Аффинная | Специфическое взаимодействие белка с лигандом, антителом или субстратным аналогом | Высокоселективная очистка целевого белка, но без самостоятельной оценки молекулярной массы |
| Гидрофобная | Различия в гидрофобности участков поверхности белка | Разделение в присутствии солей; используется преимущественно для дополнительной стадии очистки |
| Газожидкостная | Распределение летучих веществ между газовой и жидкой фазами | Для большинства белков непригодна из-за их нелетучести и термической нестабильности |
Положение белковой фракции на хроматограмме оценивают по объёму элюирования: ранний пик обычно соответствует крупным молекулам или агрегатам, поздний — более мелким белкам. Гель-фильтрация особенно информативна для анализа мономерных и олигомерных форм белка в физиологически близких условиях. При интерпретации необходимо учитывать диапазон фракционирования используемого геля и исключать перекрывание пиков. Поэтому метод одновременно служит инструментом препаративной очистки и аналитической оценки размера белковых молекул.