2) срезы парафин-фиксированной ткани, суспензии клеток (+)
3) образцы слюны
4) образцы РНК
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) основана на связывании флуоресцентно меченого ДНК-зонда с комплементарным участком нуклеиновой кислоты непосредственно в ядре клетки или срезе ткани. Метод сохраняет пространственную локализацию исследуемой последовательности, поэтому позволяет выявлять делеции, амплификации, анеуплоидии и хромосомные перестройки, одновременно оценивая морфологический контекст. Для анализа пригодны суспензии фиксированных клеток, в том числе с интерфазными ядрами или метафазными хромосомами, а также срезы формалин-фиксированной ткани, залитой в парафин.
В парафиновых срезах перед гибридизацией выполняют депарафинизацию, протеолитическую обработку и, при необходимости, восстановление доступности ДНК; затем ДНК денатурируют и проводят гибридизацию с выбранными зондами. Изолированная ДНК, полученная из гомогенизированной ткани, уже лишена клеточной и хромосомной структуры, поэтому такой материал обычно исследуют методами ПЦР, секвенирования или сравнительной геномной гибридизации, а не классическим FISH. Аналогично, нативная слюна и выделенная РНК не являются стандартными материалами для ДНК-FISH, хотя клетки буккального эпителия из слюны после специального выделения могут быть подготовлены для исследования, а RNA-FISH применяется для определения РНК непосредственно в фиксированных клетках или тканях.
| Биологический материал | Пригодность для FISH | Диагностическое значение или ограничение |
|---|---|---|
| Срезы формалин-фиксированной ткани, залитой в парафин | Да | Позволяют выявлять амплификации, делеции и перестройки с сохранением тканевой архитектуры; требуется предварительная подготовка среза. |
| Суспензии фиксированных клеток | Да | Используются для анализа интерфазных ядер и метафазных хромосом; оценивают число и локализацию флуоресцентных сигналов. |
| Свежая или нативная ткань с сохранёнными клетками | Возможна после фиксации и подготовки | Материал может быть превращён в клеточную суспензию, отпечаток или криосрез, пригодный для гибридизации. |
| Изолированная ДНК из гомогенизированной ткани | Нет для классического FISH | Отсутствует клеточная и хромосомная пространственная организация; предпочтительны ПЦР, секвенирование или другие методы анализа выделенной ДНК. |
| Нативная слюна | Обычно нет | Содержит небольшое и вариабельное количество клеток; после выделения буккальных клеток материал может быть специально подготовлен для FISH. |
| Выделенная РНК | Нет для стандартного ДНК-FISH | Изолированная РНК не сохраняет внутриклеточную локализацию; для её визуализации применяют RNA-FISH на фиксированных клетках или тканевых срезах. |
Качество результата определяется сохранностью ядер, доступностью мишени и специфичностью используемого зонда. Интерпретация проводится по числу и расположению сигналов с учётом диагностических порогов лаборатории и обязательных положительных и отрицательных контролей. Таким образом, сочетание парафиновых срезов и клеточных суспензий соответствует принципу метода: мишень должна находиться в сохранённой клеточной или тканевой структуре.