2) фиксация в гидрофобном слое
3) фиксация через взаимодействие с ионами тяжёлых металлов
4) связь денатурированного энзима с компонентами электрода
Сополимеризация с другими энзимами или белками является способом иммобилизации биокатализатора в ферментном электроде. При этом молекулы фермента включаются в формирующуюся полимерную или белковую сетку за счёт образования поперечных связей и совместного формирования матрицы. Такая фиксация удерживает фермент вблизи поверхности электрода, предотвращает его вымывание и сохраняет доступ субстрата к активному центру.
Ферментный электрод содержит биокаталитический слой и электрохимический преобразователь. В ходе реакции фермент превращает определяемый субстрат в продукт, электроактивные свойства которого либо напрямую регистрируются электродом, либо преобразуются через медиатор. Эффективность иммобилизации оценивают по сохранению каталитической активности, стабильности при многократном использовании, проницаемости матрицы для субстрата и скорости переноса электронов.
| Способ фиксации | Основной механизм | Особенности применения в ферментном электроде |
|---|---|---|
| Сополимеризация с белками или другими энзимами | Формирование совместной полимерной либо сшитой белковой матрицы | Фермент удерживается у поверхности электрода; возможно сочетание нескольких биокатализаторов в одном чувствительном слое |
| Адсорбция | Неионные, электростатические и гидрофобные взаимодействия с поверхностью носителя | Метод прост, но связь относительно слабая; возможны десорбция и снижение стабильности сигнала |
| Ковалентное связывание | Образование прочных химических связей между функциональными группами фермента и электрода | Высокая устойчивость фиксации, однако неправильная ориентация или модификация активного центра могут уменьшить активность |
| Включение в полимерный гель | Физическое удержание молекул фермента в объёме проницаемой сетки | Фермент не контактирует непосредственно с электродом; чувствительность зависит от диффузии субстрата и продукта |
| Микро- или наноинкапсуляция | Помещение фермента в полупроницаемую мембрану или капсулу | Обеспечивает защиту от денатурации, но увеличивает диффузионный барьер и может замедлять отклик |
| Связывание с ионами тяжёлых металлов | Координация функциональных групп белка с ионами металлов | Обычно не рассматривается как универсальный способ иммобилизации: тяжёлые металлы часто ингибируют или денатурируют фермент |
Денатурированный фермент утрачивает нативную пространственную структуру и, как правило, каталитическую активность, поэтому его фиксация не обеспечивает полноценной работы электрода. Гидрофобный слой может служить защитной мембраной или компонентом селективного покрытия, но сам по себе не является оптимальным способом иммобилизации биокатализатора. Выбор матрицы определяют природой фермента, размером субстрата, необходимой селективностью и требуемой стабильностью аналитического сигнала.