2) 3 раза
3) 10 раз
4) 5 раз
Правильный ответ — однократная заморозка и разморозка материала. В лабораторной диагностике ПЦР это относится к стандартному преаналитическому требованию: образец или выделенную нуклеиновую кислоту следует разделять на аликвоты, чтобы в рабочем процессе не подвергать один и тот же объём повторным циклам замораживания и оттаивания. Повторное использование замороженного материала допустимо только при наличии документированной валидации методики, подтверждающей сохранение его аналитических характеристик.
При оттаивании изменяются физико-химические свойства образца: происходит перераспределение растворённых компонентов, возможна активация нуклеаз, повреждение клеточных структур и частичная деградация ДНК или особенно лабильной РНК. Многократные циклы способствуют фрагментации нуклеиновых кислот, снижению доступности мишени для амплификации и увеличению вариабельности концентрации копий. Это может привести к повышению порогового цикла (Ct/Cq), слабому сигналу, ложноотрицательному результату при низкой вирусной или микробной нагрузке и снижению воспроизводимости исследования.
Для предупреждения потери диагностически значимого материала образцы хранят при температуре, установленной валидированной СОП, размораживают в контролируемых условиях и после перемешивания используют полностью либо неиспользованный остаток утилизируют. Особенно строгий контроль необходим для РНК-содержащих объектов, поскольку РНК быстрее подвергается гидролитической и ферментативной деградации. Поэтому в тестовой ситуации нормативно обоснованным считается однократный цикл размораживания.
| Число циклов замораживания–размораживания | Ожидаемое влияние на материал | Лабораторная тактика |
|---|---|---|
| 0 | Сохраняется исходное состояние образца при соблюдении условий хранения. | Предпочтительно использовать свежий материал или сразу подготовить аликвоты. |
| 1 | Обычно не приводит к существенному ухудшению качества при правильной температуре и ограниченном времени оттаивания. | Допустимый стандартный режим для проведения ПЦР. |
| 2–3 | Возможны начальная деградация нуклеиновых кислот и изменение концентрации мишени, особенно в образцах с низким содержанием патогена. | Не использовать рутинно; допустимость оценивают только по валидированному протоколу. |
| 4–5 | Возрастает риск фрагментации ДНК/РНК, ингибирования реакции и расхождения результатов при повторном исследовании. | Результат требует осторожной интерпретации; предпочтительно исследовать новую аликвоту. |
| 10 и более | Высока вероятность существенной потери амплифицируемой мишени и снижения аналитической чувствительности. | Такой режим не считается приемлемым для стандартной диагностики. |
| Аликвотирование до замораживания | Минимизирует повторное воздействие температурных колебаний и контакт материала с внешней средой. | Рекомендуемый способ организации хранения и подготовки образцов. |
Однократное оттаивание не заменяет требований к температуре хранения, срокам годности и защите от контаминации. Перед постановкой реакции необходимо оценивать целостность образца, отсутствие ингибиторов и соответствие объёма выделенной нуклеиновой кислоты методике. При сомнительном результате целесообразно повторить исследование из исходной необработанной аликвоты, а не многократно размораживать тот же материал.