2) FISH (+)
3) MLPA
4) высокопроизводительное секвенирование
Золотым стандартом выявления амплификации MYCN при нейробластоме считают флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH). Метод использует флуоресцентно меченую ДНК-зондовую последовательность к локусу MYCN на 2p24.3 и контрольный зонд, обычно к центромерному участку хромосомы 2. В ядрах опухолевых клеток оценивают количество сигналов и их соотношение; амплификация характеризуется выраженным превышением числа сигналов MYCN над контрольными сигналами, часто при отношении более 4, однако окончательный порог определяется валидированным лабораторным протоколом.
Преимущество FISH состоит в возможности исследовать амплификацию непосредственно в отдельных опухолевых клетках, сохраняя их морфологический и тканевой контекст. Это позволяет выявлять внутриопухолевую гетерогенность, отличать истинную амплификацию от полисомии хромосомы 2 и учитывать наличие клонов с различным числом копий гена. Результат имеет непосредственное прогностическое значение: амплификация MYCN является неблагоприятным биологическим фактором и учитывается при стратификации риска и выборе интенсивности лечения нейробластомы.
MLPA и методы секвенирования также способны оценивать число копий гена, но используются преимущественно как альтернативные или дополнительные технологии. Для MLPA требуется выделенная ДНК, поэтому метод не показывает распределение амплификации между клетками; NGS может зависеть от опухолевой клеточности, глубины покрытия и алгоритма анализа вариаций числа копий. Секвенирование по Сенгеру предназначено главным образом для выявления точечных вариантов и небольших инделов и не является методом выбора для количественной оценки амплификации.
| Метод | Что оценивает | Роль при исследовании MYCN | Основное ограничение |
|---|---|---|---|
| FISH | Число сигналов локус-специфичного зонда в отдельных клетках и соотношение с контрольным участком хромосомы 2 | Референтный метод подтверждения амплификации; позволяет оценить клеточную гетерогенность | Требует качественного опухолевого материала и правильно выбранных контрольных зондов |
| MLPA | Относительное количество копий участков ДНК после выделения и амплификации зондов | Количественная альтернатива для анализа делеций и амплификаций, включая MYCN | Не показывает, в каких именно клетках находится изменение; результат зависит от качества ДНК и состава образца |
| Высокопроизводительное секвенирование | Последовательность генома или панели генов, а также косвенные признаки изменений числа копий | Может выявлять амплификацию одновременно с мутациями и другими геномными нарушениями | Требует биоинформатического расчёта copy-number alterations; чувствительность зависит от покрытия и опухолевой клеточности |
| Секвенирование по Сенгеру | Точечные замены и небольшие вставки или делеции в анализируемом участке | Не используется как стандарт для определения увеличения числа копий MYCN | Низкая пригодность для количественной оценки амплификации и обнаружения субклонов |
| Кариотипирование или сравнительная геномная гибридизация | Крупные хромосомные перестройки и изменения числа копий на уровне всего генома | Может выявлять широкие геномные нарушения, сопутствующие амплификации MYCN | Кариотипирование имеет недостаточное разрешение, а массивная гибридизация не обеспечивает клеточной локализации изменения |
Интерпретация результата FISH должна проводиться с учётом морфологии опухоли и качества материала, поскольку неравномерное распределение опухолевых клеток способно влиять на оценку. Простое увеличение числа копий MYCN без сопоставления с контрольной хромосомой 2 не всегда означает амплификацию. Выявленный статус необходимо включать в комплексную систему INRG-стратификации вместе со стадией, возрастом, гистологией, статусом 11q и другими клинико-биологическими параметрами.