2) тест на гипоосмотическое набухание (HOS-тест)
3) окрашивание с помощью эозин-нигрозина
4) флуоресцентное мечение разрывов ДНК (TUNEL assay) (+)
Флуоресцентное мечение разрывов ДНК методом TUNEL не относится к прямым методам оценки жизнеспособности сперматозоидов. В основе TUNEL-исследования лежит ферментативное присоединение меченых нуклеотидов к свободным 3’-OH-концам фрагментов ДНК, что позволяет выявить одно- и двунитевые разрывы хроматина и определить степень фрагментации ДНК сперматозоидов. Таким образом, метод характеризует геномную целостность и качество хроматина, а не сохранность плазматической мембраны или способность клетки поддерживать жизненные процессы.
Оценка жизнеспособности основана преимущественно на выявлении функционально сохранной клеточной мембраны. При окрашивании эозином живые сперматозоиды с неповрежденной мембраной не пропускают краситель и остаются неокрашенными, тогда как нежизнеспособные клетки окрашиваются. В системе эозин–нигрозин дополнительно используется контрастный фон, что облегчает подсчет неокрашенных живых и окрашенных погибших сперматозоидов. HOS-тест оценивает функциональную целостность мембраны по осмотическому ответу: в гипоосмотической среде у жизнеспособных клеток возникает набухание и характерное закручивание хвоста.
Сперматозоид может сохранять неповрежденную мембрану и проявлять признаки жизнеспособности, одновременно имея выраженную фрагментацию ДНК. Поэтому результаты TUNEL и тестов жизнеспособности не являются взаимозаменяемыми и применяются для характеристики разных аспектов качества спермы.
| Метод | Основной принцип | Что оценивается | Типичный признак жизнеспособности или повреждения |
|---|---|---|---|
| Эозин | Проникновение красителя через поврежденную плазматическую мембрану | Целостность мембраны и жизнеспособность клетки | Живые сперматозоиды не окрашиваются; погибшие приобретают розово-красную окраску |
| Эозин–нигрозин | Витальная окраска с контрастированием препарата нигрозином | Соотношение живых и нежизнеспособных сперматозоидов | Живые клетки светлые на темном фоне, погибшие окрашены эозином |
| HOS-тест | Реакция мембраны на гипоосмотическую нагрузку | Функциональная целостность мембраны | У жизнеспособных клеток наблюдается набухание и закручивание хвоста |
| TUNEL assay | Флуоресцентная маркировка свободных концов фрагментов ДНК | Фрагментация ДНК и повреждение хроматина | Положительный сигнал указывает на разрывы ДНК, но не доказывает гибель клетки |
| Оценка подвижности | Микроскопическое определение движения сперматозоидов | Функциональную активность и прогрессивную подвижность | Прогрессивное движение поддерживает функциональную состоятельность, но само по себе не заменяет тест жизнеспособности |
| Интерпретация результатов | Раздельная оценка мембраны и генетического материала | Комплексное качество сперматозоидов | Жизнеспособность может быть сохранена при одновременно повышенной фрагментации ДНК |
Следовательно, TUNEL применяют для диагностики повреждения сперматозоидной ДНК и оценки риска снижения репродуктивного потенциала, а не для непосредственного подсчета живых клеток. Показатели TUNEL целесообразно интерпретировать совместно с концентрацией, подвижностью, морфологией и результатами витальных тестов. Для непосредственной оценки жизнеспособности используют методы, основанные на проницаемости мембраны или ее осмотической реактивности.