2) средами, позволяющими проводить культивирование эмбрионов на всех этапах, а также работать длительное время вне инкубатора
3) культуральными средами, предназначенными только для раннего культивирования до стадии дробления
4) системой культуральных сред, состоящей из нескольких этапов (сред) и адаптированной для культивирования эмбрионов на различных стадиях (+)
Последовательные культуральные среды представляют собой многоэтапную систему, в которой состав каждой среды адаптирован к определённому периоду доимплантационного развития эмбриона. Обычно первая среда применяется на ранних стадиях дробления, а последующая — после компактизации, при формировании морулы и бластоцисты. Такой подход основан на изменении метаболических и биосинтетических потребностей эмбриона по мере его развития.
До компактизации эмбрион преимущественно использует пируват и лактат, характеризуется сравнительно низкой биосинтетической активностью и в значительной степени зависит от материнских РНК и белков, накопленных в ооците. После активации эмбрионального генома, увеличения числа клеток и формирования межклеточных контактов возрастает потребность в глюкозе, аминокислотах и других субстратах, необходимых для синтеза макромолекул и образования бластоцеля. Поэтому переход между средами позволяет последовательно изменять концентрацию энергетических субстратов, аминокислот и вспомогательных компонентов в соответствии со стадией развития.
Определяющим признаком последовательной системы является не продолжительность культивирования сама по себе, а наличие нескольких специализированных сред и регламентированной смены среды. Она не предназначена исключительно для раннего или исключительно для продлённого культивирования. Среды, обеспечивающие развитие от зиготы до бластоцисты без изменения состава, относятся к одноступенчатым, или непрерывным, культуральным системам; устойчивость к длительной работе вне инкубатора также не является критерием последовательной среды.
| Критерий | Ранняя среда последовательной системы | Поздняя среда последовательной системы | Одноступенчатая среда |
|---|---|---|---|
| Основной период применения | Оплодотворение и раннее дробление | Компактизация, морула и бластоциста | Все стадии от зиготы до бластоцисты |
| Типичная продолжительность этапа | Примерно до 3-х суток развития | Обычно с 3-х до 5–6-х суток | Весь период культивирования по валидированному протоколу |
| Преимущественные энергетические субстраты | Пируват и лактат; содержание глюкозы обычно ограничено | Возрастает роль глюкозы при сохранении других субстратов | Полный набор субстратов доступен одновременно |
| Аминокислотный профиль | Акцент на компонентах, соответствующих раннему дроблению | Расширенный состав для высокой биосинтетической активности | Компоненты для разных стадий объединены в одной формуле |
| Необходимость смены среды | Предусмотрен переход на следующую среду | Используется после регламентированной смены | Смена состава не обязательна; возможно обновление той же среды |
| Биологический принцип | Поддержка раннего метаболического фенотипа эмбриона | Поддержка посткомпактизационного развития и бластуляции | Эмбрион самостоятельно использует необходимые компоненты единой среды |
| Основной лабораторный риск | Дополнительная манипуляция при смене среды может нарушать стабильность температуры, pH и газового режима | Накопление продуктов метаболизма при длительном непрерывном культивировании зависит от протокола и объёма капли | |
Последовательная концепция физиологически обоснована стадийными изменениями энергетического обмена эмбриона, однако она не считается универсально превосходящей одноступенчатые системы. Результат зависит от качества конкретной среды, условий инкубации и валидации протокола в лаборатории. При любой системе необходимо минимизировать колебания температуры, pH и осмоляльности, а также продолжительность нахождения эмбрионов вне инкубатора. Выбор среды должен основываться на показателях оплодотворения, дробления, бластуляции и клинических исходах, контролируемых в рамках системы менеджмента качества.