2) культуральным, для последовательного культивирования эмбрионов
3) манипуляционным, предназначенным для работы с биологическим материалом вне СО2-инкубатора (+)
4) специальным, используемым в процессе криоконсервации
Среды на основе HEPES относят к манипуляционным, поскольку они предназначены для кратковременной работы с ооцитами, сперматозоидами и эмбрионами вне атмосферы CO2-инкубатора: при осмотре под микроскопом, денудации ооцитов, проведении ИКСИ, оценке качества и выполнении других процедур. HEPES — цвиттерионный буфер с эффективной буферной ёмкостью в физиологическом диапазоне pH; он поддерживает стабильность кислотно-основного состояния среды при контакте с обычным атмосферным воздухом.
В стандартных культуральных средах основная буферная система представлена бикарбонатом, равновесие которого зависит от содержания CO2 в газовой фазе. Вне инкубатора такая система быстро смещается в щелочную сторону, что может нарушать клеточный метаболизм, работу мембранных транспортных систем и развитие эмбриона. HEPES снижает зависимость pH от концентрации CO2, поэтому обеспечивает более безопасное кратковременное пребывание биологического материала на рабочем столе.
HEPES-среда не является специальной криоконсервационной средой и не определяется как среда для одноступенчатого или последовательного культивирования. Культуральные среды предназначены для длительного развития эмбриона в условиях контролируемой температуры, газового состава и влажности, тогда как манипуляционные среды обеспечивают сохранность материала во время процедур вне инкубатора. При этом окончательная область применения всегда уточняется по инструкции производителя: некоторые культуральные составы также могут содержать HEPES как дополнительный буфер.
| Тип среды | Основная буферная система | Условия применения | Основное назначение | Ключевой отличительный признак |
|---|---|---|---|---|
| HEPES-буферная манипуляционная | HEPES, часто в сочетании с бикарбонатом | Вне CO2-инкубатора, при контролируемой температуре | Кратковременные манипуляции с гаметами и эмбрионами | Стабильный pH в атмосферном воздухе |
| Бикарбонатная культуральная | Бикарбонат/CO2 | Внутри CO2-инкубатора | Длительное культивирование эмбрионов | Зависимость pH от заданной концентрации CO2 |
| Среда для одноступенчатого культивирования | Обычно бикарбонатная, иногда с дополнительным буфером | Инкубатор с контролем газа | Поддержание развития эмбриона в одном составе среды | Необходимость стабильных условий инкубации на протяжении всего периода |
| Среда для последовательного культивирования | Бикарбонатная, состав меняется по этапам развития | CO2-инкубатор | Поэтапное обеспечение метаболических потребностей эмбриона | Использование разных составов на отдельных стадиях культивирования |
| Криоконсервационная среда | Специальные криопротекторы: проникающие и непроникающие | Процедуры витрификации или размораживания | Предотвращение повреждения клеток при охлаждении и нагревании | Наличие криопротекторов и осмотически сбалансированного протокола |
| MOPS-буферная манипуляционная | MOPS | Вне CO2-инкубатора | Кратковременная обработка биологического материала | Альтернативный физиологический буфер с независимостью от CO2 |
При использовании HEPES-среды необходимо соблюдать заданные производителем температуру, осмоляльность и сроки экспозиции. Длительное пребывание эмбрионов в манипуляционной среде не заменяет полноценного культивирования. Следует минимизировать воздействие интенсивного света и не допускать загрязнения открытой капли. Таким образом, определяющим критерием является способность среды поддерживать физиологический pH во время кратковременной работы вне CO2-инкубатора.