2) фосфатно-солевой буфер
3) бикарбонатный буфер (+)
4) человеческий сывороточный альбумин
В культуральных средах для эмбриокультуры основную буферную функцию выполняет бикарбонатная система, представленная равновесием углекислого газа, угольной кислоты и гидрокарбоната: CO2 + H2O ⇄ H2CO3 ⇄ H+ + HCO3−. Ее эффективность определяется одновременно концентрацией бикарбоната в среде и парциальным давлением CO2 в атмосфере инкубатора. При правильно подобранном соотношении этих компонентов поддерживается физиологический для раннего эмбриона диапазон pH, обычно около 7,2–7,4.
Механизм буферного действия заключается в связывании избытка ионов водорода гидрокарбонатом с образованием угольной кислоты, которая при необходимости превращается в CO2 и воду. Поэтому открытие чашки и потеря растворенного CO2 приводят к сдвигу среды в щелочную сторону, а нарушение газового режима или чрезмерное образование кислых метаболитов — к закислению. Такие изменения могут нарушать активность ферментов, клеточный метаболизм, деление бластомеров и формирование бластоцисты.
Глюкоза является энергетическим субстратом, человеческий сывороточный альбумин — белковым и коллоидно-осмотическим компонентом, а фосфатно-солевой буфер преимущественно применяют для промывания клеток и манипуляций вне условий инкубатора. Фосфатная система не обеспечивает оптимального сопряжения с контролируемой атмосферой CO2 и в составе полноценной культуральной среды может быть нежелательна из-за риска взаимодействия с кальцием и магнием. Дополнительные буферы, например HEPES или MOPS, иногда используют в средах для кратковременной работы вне инкубатора, но в стандартной системе эмбриокультуры ведущей остается бикарбонатно-углекислотная система.
| Компонент или система | Основная функция | Механизм или особенность | Типичное применение в эмбриологии |
|---|---|---|---|
| Бикарбонатный буфер | Поддержание стабильного pH культуральной среды | Равновесие HCO3−/CO2 регулируется концентрацией гидрокарбоната и газовой фазой | Основная буферная система сред, используемых в CO2-инкубаторе |
| Атмосфера с контролируемым CO2 | Поддержание равновесия бикарбонатной системы | Потеря CO2 повышает pH, увеличение его содержания снижает pH | Инкубация чашек и микрокапель при заданной температуре и газовом составе |
| HEPES или MOPS | Быстрое поддержание pH при кратковременном контакте с воздухом | Не зависят непосредственно от концентрации CO2, но могут быть вспомогательными буферами | Среды для манипуляций, оценки и переноса эмбрионов вне инкубатора |
| Фосфатно-солевой буфер | Изотоническое промывание и временное поддержание клеток | Содержит фосфатные соли и электролиты; не является предпочтительной системой для длительной эмбриокультуры | Промывание ооцитов, эмбрионов, инструментов и лабораторных поверхностей |
| Глюкоза | Источник энергии и метаболический субстрат | Участвует в энергетическом обмене, но не обеспечивает буферную емкость среды | Компонент питательного состава среды в концентрации, соответствующей стадии развития |
| Человеческий сывороточный альбумин | Белковая и коллоидно-осмотическая поддержка | Стабилизирует мембраны, связывает отдельные липофильные соединения и снижает адгезию клеток к поверхностям | Добавка к средам для культивирования и манипуляций |
| Контроль качества буферной системы | Подтверждение пригодности среды для эмбриокультуры | Оценивают pH, осмолярность, температуру, газовый режим и стабильность после уравновешивания | Предварительное equilibrирование среды и регулярный контроль параметров инкубатора |
Для бикарбонат-содержащих сред важны не только химический состав, но и правильное предварительное уравновешивание в атмосфере инкубатора. Измерение pH следует проводить в условиях, максимально соответствующих рабочей температуре и газовой фазе, поскольку выход среды на воздух изменяет ее кислотно-основное состояние. Нарушение буферной емкости может проявляться снижением качества эмбрионов даже при сохранении стерильности и нормальной осмолярности. Поэтому бикарбонатный буфер рассматривают как часть единой системы среда — CO2-инкубатор — температурный режим .