2) УФ-спектрометрии (+)
3) рефрактометрии
4) поляриметрии
Кальциферолы, включая эргокальциферол (витамин D2) и холекальциферол (витамин D3), относятся к жирорастворимым секостероидам. В их молекуле присутствует сопряжённая триеновая система, которая интенсивно поглощает ультрафиолетовое излучение с максимумом примерно при 264–265 нм. Интенсивность поглощения пропорциональна концентрации вещества в растворе и описывается законом Бугера—Ламберта—Бера.
Фармакопейное количественное определение основано на измерении оптической плотности испытуемого раствора при установленной длине волны после растворения субстанции в подходящем растворителе. Содержание рассчитывают по удельному показателю поглощения либо сравнением с раствором стандартного образца — в соответствии с требованиями конкретной фармакопейной статьи. Поэтому правильным является метод УФ-спектрометрии: он непосредственно использует характерное электронное поглощение хромофорной системы кальциферолов.
ИК-спектроскопия преимущественно применяется для идентификации по совокупности полос колебательных спектров, но менее удобна для прямого количественного анализа таких соединений. Рефрактометрия и поляриметрия оценивают соответственно показатель преломления и оптическое вращение; эти параметры не обладают достаточной специфичностью для определения содержания кальциферолов в фармацевтическом объекте. При наличии сложной матрицы или необходимости одновременного контроля примесей может использоваться высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-детектированием.
| Метод или показатель | Физико-химическая основа | Основное фармакопейное назначение | Диагностическая или аналитическая характеристика |
|---|---|---|---|
| УФ-спектрометрия | Поглощение света сопряжённой триеновой системой при около 265 нм | Количественное определение кальциферолов | Концентрация связана с оптической плотностью по закону Бугера—Ламберта—Бера |
| Удельный показатель поглощения | Оптическая плотность стандартного раствора вещества известной концентрации | Расчёт содержания субстанции по фармакопейной формуле | Требует соблюдения установленной длины волны, толщины кюветы и растворителя |
| ИК-спектроскопия | Поглощение инфракрасного излучения при колебательных переходах функциональных групп | Идентификация и подтверждение подлинности | Перекрывание полос и влияние матрицы ограничивают прямое количественное применение |
| ВЭЖХ с УФ-детектированием | Разделение компонентов в колонке с последующим измерением УФ-поглощения | Высокоспецифичное определение и контроль родственных примесей | Более селективна, но требует хроматографического оборудования и валидированной методики |
| Рефрактометрия | Измерение показателя преломления раствора | Контроль простых растворов и некоторых жидких субстанций | Недостаточная специфичность при присутствии вспомогательных веществ и примесей |
| Поляриметрия | Измерение угла вращения плоскости поляризации | Контроль оптически активных веществ | Не обеспечивает надёжного прямого количественного определения кальциферолов в лекарственной форме |
При проведении анализа необходимо защищать растворы и образцы от интенсивного света и окисления, поскольку кальциферолы чувствительны к фотодеградации. Существенное значение имеют чистота растворителя, корректность холостого опыта и отсутствие посторонних веществ, поглощающих в области максимума. Валидация УФ-методики включает оценку специфичности, линейности, правильности, прецизионности и стабильности аналитического раствора.