2) фильтровальная бумага, мембрана, гель, фильтровальная бумага
3) фильтровальная бумага, гель, мембрана, фильтровальная бумага (+)
4) фильтровальная бумага, гель, фильтровальная бумага, мембрана
При электропереносе после разделения в ПААГ белки, связанные с додецилсульфатом натрия (SDS), приобретают преимущественно отрицательный суммарный заряд. Поэтому в электрическом поле они движутся от катода к аноду. Мембрана должна располагаться непосредственно со стороны анода относительно геля, чтобы белковые полосы переходили из геля на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану; отсюда правильная последовательность: фильтровальная бумага, гель, мембрана, фильтровальная бумага.
Фильтровальная бумага, пропитанная буфером для переноса, обеспечивает непрерывный ионный контакт, равномерное распределение тока и плотное прилегание слоёв. В стандартной полной кассете сэндвич дополнительно ограничивается губками, которые поддерживают давление и удерживают буфер; однако среди перечисленных функциональных слоёв они не учитываются. Неправильная ориентация геля и мембраны приводит к снижению или отсутствию сигнала, поскольку белки мигрируют в сторону электрода, не соприкасаясь с мембраной.
| Элемент системы | Положение от катода к аноду | Основная функция | Последствия нарушения |
|---|---|---|---|
| Катод | Начало направления переноса | Отрицательный электрод, от которого движутся анионные белково-SDS-комплексы | Изменение полярности меняет направление миграции |
| Фильтровальная бумага со стороны катода | Первый слой | Смачивается буфером, передаёт ток и обеспечивает равномерный контакт с гелем | Сухие участки вызывают локальное повышение сопротивления и неравномерный перенос |
| Полиакриламидный гель | После катодной бумаги | Матрица, содержащая разделённые электрофорезом белки | Неплотное прилегание способствует размыванию и потере белка |
| Мембрана | Непосредственно со стороны анода от геля | Адсорбирует белки для последующего иммунодетектирования | При размещении до геля белки не переходят на мембрану |
| Фильтровальная бумага со стороны анода | После мембраны | Поддерживает буферный контакт и отвод ионов к аноду | Нарушение контакта ухудшает эффективность переноса |
| Анод | Конец направления переноса | Положительный электрод, к которому движутся отрицательно заряженные белки | Ошибочная полярность направляет белки в противоположную сторону |
| Материал мембраны | Рабочая поверхность после переноса | Нитроцеллюлоза связывает белки преимущественно гидрофобными взаимодействиями, PVDF требует предварительного смачивания метанолом | Неподготовленная или повреждённая мембрана снижает связывание и качество иммунного сигнала |
Ориентацию сэндвича контролируют по маркировке кассеты и расположению электродов, а не только по внешнему виду слоёв. Эффективность переноса зависит также от времени, силы тока, состава буфера, размера белка и толщины геля. После переноса полноту фиксации белков на мембране можно оценить окрашиванием Ponceau S, а специфический белок выявляют антителами в рамках иммуноблоттинга. Таким образом, ключевой критерий правильной сборки — расположение мембраны между гелем и анодом.