2) величине площадей основных пиков у испытуемого и стандартного растворов (+)
3) величине удельного вращения вещества
4) времени удерживания основных пиков у испытуемого и стандартного растворов
При количественном определении методом высокоэффективной жидкостной хроматографии содержание вещества устанавливают по площади его хроматографического пика. Площадь представляет собой интеграл сигнала детектора за время элюирования и при постоянных условиях анализа пропорциональна количеству аналита, поступившего на детектор. Поэтому площадь основного пика испытуемого раствора сопоставляют с площадью соответствующего пика стандартного раствора известной концентрации.
Расчёт обычно выполняют методом внешнего стандарта: концентрацию или массу вещества в пробе определяют с учётом отношения площадей пиков, концентрации стандартного раствора, навески, объёма разведений, чистоты стандарта и, при необходимости, коэффициента отклика детектора. Время удерживания используется преимущественно для идентификации вещества и подтверждения соответствия пика аналиту, но само по себе не отражает его количество. Удельный показатель поглощения и удельное вращение имеют диагностическое значение в спектрофотометрическом и поляриметрическом анализе соответственно, однако не являются основным параметром количественной оценки при ВЭЖХ.
Достоверность результата обеспечивается совпадением или допустимым соответствием условий хроматографирования для стандартного и испытуемого растворов, а также выполнением требований пригодности системы. Оценивают разрешение соседних пиков, стабильность времени удерживания, повторяемость площадей и линейность зависимости площадь — концентрация .
| Параметр | Основная функция в анализе | Интерпретация |
|---|---|---|
| Площадь пика | Количественная оценка компонента | Пропорциональна количеству вещества при валидированных условиях и используется в расчёте содержания |
| Высота пика | Дополнительная количественная характеристика | Может зависеть от ширины пика и условий разделения; обычно менее предпочтительна, чем площадь |
| Время удерживания | Идентификация компонента | Сопоставление с временем удерживания стандарта подтверждает принадлежность пика, но не его концентрацию |
| Концентрация стандартного раствора | Основа сравнительного расчёта | Позволяет перевести отношение площадей пиков в концентрацию или массу аналита в испытуемой пробе |
| Коэффициент отклика детектора | Коррекция различий в чувствительности детектора | Необходим при использовании относительного отклика или при количественном определении нескольких компонентов |
| Удельный показатель поглощения | Спектрофотометрическая характеристика | Применим при расчётах по закону Бугера—Ламберта—Бера, но не заменяет интегрирование хроматографического пика |
| Удельное вращение | Поляриметрическая и стереохимическая характеристика | Используется для оценки оптической активности и подлинности, но не является стандартным параметром количественного расчёта методом ВЭЖХ |
При использовании внутреннего стандарта дополнительно рассчитывают отношение площади пика аналита к площади пика внутреннего стандарта, что снижает влияние вариаций объёма инъекции и пробоподготовки. Для надёжной идентификации учитывают одновременно время удерживания, спектральную информацию при использовании диодно-матричного детектора и специфичность разделения. Окончательная методика должна быть подтверждена показателями правильности, прецизионности, линейности, специфичности и диапазона применения.