2) хемилюминесцентный
3) радиоактивной метки
4) флуоресцентной метки
Метод детекции на основе цветной реакции основан на использовании ферментной метки, связанной с антителом. После разделения белков электрофорезом, переноса их на мембрану и последовательного связывания с первичными и фермент-мечеными вторичными антителами добавляют хромогенный субстрат. Под действием фермента, чаще пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы, образуется окрашенный, обычно нерастворимый продукт непосредственно в зоне расположения выявляемого белка.
Появление окрашенной полосы свидетельствует о наличии специфического антигена или антитела, а ее положение позволяет оценить соответствие молекулярной массе исследуемого компонента. В иммунобиологических препаратах метод применяют для подтверждения подлинности белка и выявления посторонних белковых примесей по дополнительным полосам. Его преимуществами являются простота, наглядность, относительная доступность оборудования и возможность визуальной регистрации результата; ограничениями служат меньшая чувствительность и более узкий линейный диапазон по сравнению с хемилюминесцентной детекцией.
| Метод детекции | Метка и принцип регистрации | Основные особенности | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Цветная реакция | Ферментная метка; образование окрашенного продукта из хромогенного субстрата | Наглядность, простота, возможность визуальной оценки | Подтверждение подлинности и выявление белковых примесей |
| Хемилюминесцентный | Ферментный катализ реакции с испусканием света | Высокая чувствительность и широкий динамический диапазон | Регистрация низких концентраций белка и количественный анализ |
| Флуоресцентный | Флуорофор возбуждается светом определенной длины волны | Возможна мультиплексная детекция, требуется специализированный сканер | Одновременное выявление нескольких белков |
| Радиоактивный | Радионуклидная метка и регистрация радиоактивного излучения | Высокая чувствительность, но радиационная опасность и сложная утилизация | Специальные научные и референсные исследования |
| Положительный результат | Специфическая окрашенная полоса в ожидаемой области молекулярной массы | Подтверждает наличие целевого компонента | Оценка подлинности препарата |
| Признак возможной примеси | Дополнительные неспецифические полосы или изменение профиля | Требует сопоставления с контролями и нормативными критериями | Оценка чистоты иммунобиологического препарата |
Достоверность результата обеспечивают отрицательный и положительный контроли, маркер молекулярной массы и использование валидированных антител. Интенсивность окрашивания оценивают визуально или денситометрически, однако количественная интерпретация допустима только в пределах установленного линейного диапазона. Таким образом, цветная детекция сочетает специфичность иммунологической реакции с простой регистрацией окрашенного продукта на мембране.