2) реплицирования цепи ДНК при помощи ДНК-полимеразы
3) расхождения цепей двухцепочечной молекулы ДНК
4) исправления химических повреждений и разрывов в молекулах ДНК
Гибридизация ДНК — это ассоциация двух комплементарных одноцепочечных участков нуклеиновых кислот с образованием двуцепочечной структуры. Соединение происходит за счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями: аденином и тимином, гуанином и цитозином. Ковалентного сшивания цепей при этом не происходит; процесс обратим и зависит от температуры, ионной силы раствора и степени соответствия последовательностей.
В молекулярной диагностике гибридизация лежит в основе взаимодействия специфического меченого зонда с искомой последовательностью ДНК или РНК. Такой принцип используется, в частности, при выявлении Mycobacterium tuberculosis complex и молекулярном определении генетических маркеров лекарственной устойчивости. Репликация представляет собой ферментативное копирование ДНК ДНК-полимеразой, денатурация — разделение комплементарных цепей, а репарация — исправление повреждений генетического материала; поэтому эти процессы не соответствуют приведённому определению.
| Процесс | Основной механизм | Роль ферментов | Результат | Применение или значение |
|---|---|---|---|---|
| Гибридизация | Спаривание комплементарных одноцепочечных участков посредством водородных связей | Фермент не обязателен; определяющими являются условия среды и комплементарность | Двуцепочечный ДНК–ДНК или ДНК–РНК-гибрид | Связывание диагностического зонда с мишенью, выявление возбудителя или мутаций |
| Денатурация | Разрыв водородных связей между комплементарными цепями под действием нагревания или реагентов | Специфический фермент не требуется | Разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечные матрицы | Подготовка нуклеиновой кислоты к ПЦР и последующей гибридизации |
| Репликация | Синтез новой цепи по матричной цепи с соблюдением принципа комплементарности | ДНК-полимераза, праймаза, хеликаза и другие белки репликационного комплекса | Две дочерние молекулы ДНК | Удвоение генома перед делением клетки |
| Полимеразная цепная реакция | Многократное циклическое денатурирование, отжиг праймеров и элонгация | Термостабильная ДНК-полимераза | Экспоненциальное увеличение заданного фрагмента ДНК | Высокочувствительное обнаружение ДНК микобактерий в клиническом материале |
| Репарация | Распознавание и устранение повреждённого участка с последующим восстановлением последовательности | Эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза и другие ферменты | Восстановление целостности и структуры ДНК | Поддержание стабильности генома и предотвращение мутаций |
| Секвенирование | Определение последовательности нуклеотидов исследуемого фрагмента | Зависит от метода; используются полимеразы, праймеры или проточные системы | Нуклеотидная последовательность ДНК | Подтверждение мутаций и детальная характеристика генетических вариантов |
Специфичность гибридизации определяется прежде всего комплементарностью последовательностей и строгостью условий реакции. При высокой строгости сохраняются преимущественно полностью комплементарные дуплексы, что снижает риск неспецифического сигнала. В противотуберкулёзной диагностике этот принцип позволяет обнаруживать небольшие количества микобактериальной ДНК непосредственно в образце. Гибридизационный сигнал оценивают вместе с контролями реакции и клинико-эпидемиологическими данными пациента.