2) FSC-H; FSC-A (+)
3) FSC-A; SSC-A
4) SSC-A; FSC-H
Для дискриминации дублетов в проточной цитометрии используют график взаимосвязи FSC-H и FSC-A. Параметр FSC-A отражает интегральную площадь импульса прямого светорассеяния, а FSC-H — максимальную высоту этого импульса. У одиночных клеток, проходящих через лазерный луч последовательно, между площадью и высотой сигнала сохраняется закономерное соотношение, поэтому они формируют компактное диагональное облако.
Две клетки, одновременно находящиеся в зоне измерения, создают суммарный импульс с непропорционально увеличенной площадью: FSC-A возрастает сильнее, чем FSC-H. Такие события отклоняются от диагонального распределения синглетов и могут быть исключены отдельным гейтом. Это необходимо, чтобы дублеты или клеточные агрегаты не были ошибочно расценены как единичные клетки с повышенной экспрессией маркеров или увеличенным размером.
Оценку FSC-H/FSC-A обычно проводят после удаления технического мусора и до анализа экспрессии антигенов, жизнеспособности или субпопуляционного состава. При необходимости аналогичный контроль может дополняться анализом ширины импульса и параметров бокового светорассеяния, однако стандартным графиком для исключения дублетов остается сопоставление высоты и площади FSC-сигнала.
| Тип события | FSC-A | FSC-H | Положение на графике | Тактика интерпретации |
|---|---|---|---|---|
| Одиночная клетка нормального размера | Соответствует размеру клетки | Пропорциональна площади импульса | Вдоль основной диагонали | Включается в гейт синглетов |
| Дублет из двух сходных клеток | Значительно увеличена, близка к сумме сигналов | Увеличена в меньшей степени | Выше или правее диагонального облака | Исключается из дальнейшего анализа |
| Клеточный агрегат или конгломерат | Резко повышена | Не соответствует ожидаемому соотношению с FSC-A | Вне области синглетов | Расценивается как множественное событие |
| Крупная одиночная клетка | Повышена вследствие большего размера | Повышена пропорционально | Сохраняет принадлежность к диагональному кластеру | Не исключается только на основании высокого FSC |
| Клеточный фрагмент или дебрис | Низкая | Низкая | Нижняя часть диаграммы, часто вне основного гейта | Удаляется на этапе первичной очистки данных |
| Событие с аномальной формой импульса | Несоответствует ожидаемой пропорции | Может быть нестабильной | Отдельно от плотного облака синглетов | Требует исключения или дополнительной проверки |
Дискриминация дублетов повышает точность подсчета клеточных популяций и оценки интенсивности флуоресценции. Особенно важна эта процедура при исследовании образцов с высокой клеточностью, выраженной агрегацией или после стимуляции клеток. Гейт синглетов следует устанавливать по реальному распределению событий в конкретном образце, а не по фиксированным универсальным координатам. Дополнительный контроль качества включает оценку времени регистрации событий и исключение нестабильных участков потока.