2) наличие участка ДНК, комплементарного к используемым праймерам (+)
3) одноцепочечную молекулу РНК
4) двуцепочечную молекулу ДНК
Полимеразная цепная реакция без этапа обратной транскрипции предназначена для амплификации определённого участка ДНК. В ходе реакции двуцепочечная ДНК денатурирует, после чего праймеры присоединяются к комплементарным последовательностям на образовавшихся одноцепочечных матрицах. Термостабильная ДНК-полимераза достраивает новые цепи, и за каждый цикл количество копий целевого фрагмента увеличивается экспоненциально.
Поэтому результатом метода является выявление в исследуемом материале участка ДНК, содержащего последовательности, комплементарные используемым праймерам и расположенные по обе стороны амплифицируемого фрагмента. Свободная РНК не может непосредственно служить матрицей для стандартной ПЦР: для анализа РНК предварительно выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК (кДНК), после чего проводят ПЦР. Формулировка о двуцепочечной ДНК описывает исходное состояние большинства ДНК-матриц, но диагностически значимым является не сам факт наличия двуцепочечной молекулы, а присутствие в ней специфической последовательности-мишени.
| Объект или этап | Роль в исследовании | Результат интерпретации |
|---|---|---|
| Двуцепочечная ДНК | Исходная матрица стандартной ПЦР | Может быть амплифицирована при наличии специфической мишени |
| Участок ДНК-мишени | Фрагмент между сайтами связывания праймеров | Определяет специфичность реакции |
| Праймеры | Короткие олигонуклеотиды, комплементарные участкам матрицы | Ограничивают границы ампликона и обеспечивают начало синтеза |
| РНК без обратной транскрипции | Не преобразуется в ДНК-матрицу для стандартной ПЦР | Наличие РНК непосредственно не подтверждается |
| кДНК после обратной транскрипции | ДНК-копия исходной РНК | Позволяет выявлять РНК-содержащие вирусы или транскрипты генов |
| Ампликон | Продукт многократного копирования целевого фрагмента | Подтверждает наличие соответствующей последовательности при использовании специфичных праймеров |
Отсутствие амплификации не всегда означает отсутствие исследуемого агента или гена: причиной могут быть недостаточное количество материала, деградация нуклеиновой кислоты, ингибиторы реакции или ошибки преаналитического этапа. Для повышения надёжности используют положительный, отрицательный и внутренний контроль. В количественной ПЦР дополнительно оценивают количество исходной ДНК по циклу, на котором флуоресценция превышает установленный порог.